NEOSPORAROM 52-177/2008

a. Titlu: Investigatii epidemiologice, diagnostice, patogenetice si imunologice in neosporoza la bovine si caine in nord-vestul, centrul si sudul Romaniei

b. Acronim: NEOSPORAROM

c. Rezumatul proiectului:

De la identificarea ei la caini in 1984 in Norvegia (Bjerkas si col., 1984) si de la descrierea unui nou gen si a unei specii, Neospora caninum (Dubey si col., 1988), neosporoza a devenit o boala importanta la bovinele si cainii din lumea intrega. Neosporoza este o protozooza la bovine, care determina pierderi economice de milioane de dolari prin avorturile aparute, eliminarea vacilor cu avorturi repetate cauzate de N. caninum, reinsamantarile, posibila pierdere a lactatiei, costurile legate de stabilirea diagnosticului si asistenta profesionala (Hernandez si col., 2001). Viteii infectati prezinta semne neurologice, sunt slabiti, incapabili sa se ridice, sau sunt nascuti fara semne clinice. In biologia parazitului intervin cainele, gazda definitiva, la care se dezvolta la nivelul tubului digestiv si bovine, gazde intermediare, la care se dezvolta sistemic, mai ales la nivelul sistemului nervos central, tesut muscular scheletic si cardiac. Infectia gazdelor intermediare se realizeaza prin fitofagie, geofagie cu oochisturi sporulate (Dubey si Lindsay, 1996), dar cea mai importanta cale de contaminare este cea verticala, transplacentar (Dubey, 2003). Mecanismul transmiterii verticale nu este inca, pe deplin cunoscut, la ora actuala fiind incriminata parazitemia temporara la vacile gestante (Dubey si De Lahunta, 1993). La nivel mondial sunt citate procente de seropozitivitate intre 1,3 si 100% la caini, in functie de provenienta, iar la bovine de 0,04 pana la 77,7%, dependent de tara (Dubey si col., 2007). In Romania pana la aceasta data, nu s-au efectuat studii sistematice privind aceasta protozooza, atat la gazda definitiva cat si la gazda intermediara, existand in circuitul national de publicatii stiintifice, 4 lucrari: un studiu serologic pe 56 caini comunitari (12,5% seropozitivi), un studiu serologic pe 150 bovine (20% seropozitive), un model experimental pe soricei si cultivarea pe culturi celulare a N. caninum (Suteu O si col., 2005; Ionescu si col., 2002; Suteu O si Cozma, 2004; Suteu O si col., 2004). Directia de cercetare in care se incadreaza proiectul este Agricultura, siguranta si securitate alimentara (Cod 5), tematica Sanatate publica veterinara, diagnosticul, supravegherea si controlul bolilor la animale (Cod 5.1.14). Avand in vedere ca aceasta parazitoza este foarte putin studiata in tara noastra, faptul ca implica pierderi economice importante si datorita dificultatilor in ceea ce priveste diagnosticul avorturilor asociate cu infectii cu N. caninum, se propune, prioritar in tara noastra proiectul cu titlul “Investigatii epidemiologice, diagnostice, patogenetice si imunologice in neosporoza la bovine si caine in nord-vestul, centrul si sudul Romaniei”. Scopul acestui proiect este cunosterea reala a situatiei epidemiologice la bovine si caine privind infectia cu N. caninum si elaborarea unei strategii de supraveghere, diagnostic si prevenire a neosporozei in Romania, in vederea reducerii pierderilor economice si imbunatatirii starii de sanatate la animalele receptive.Obiectivele principale sunt: dezvoltarea unei metodologii de intretinere “in vitro” a unei suSe de N. caninum; stabilirea si verificarea unor metodologii serologice de diagnostic in neosporoza la bovine; verificarea si implementarea unor metodologii de izolare si identificare a N. caninum din tesuturi infectate (izolare pe culturi celulare, animale de laborator, identificare prin histopatologie, imunohistochimie si tehnici de biologie moleculara); realizarea unui screening serologic la vaci prin metodele implementate; efectuarea unui studiu epidemiologic privind frecventa avorturilor porduse de N. caninum la bovine din nord-vestul, centrul si sudul Romaniei prin metodele verificate si implementate; studierea raspunsului imun si a reactivitatii tisulare in infectia cu N. caninum pe modele experimentale (model caprin, murin si gerbil) si in infectii naturale la vitei; descrierea evolutiei neosporozei la caine in zone urbane si rurale, in Romania prin utilizarea examenelor coproparazitologice si serologice; reproducerea experimentala a neosporozei intestinale la caine si descrierea aspectelor patogenetice, anatomo-clinice si imunologice.

d. Obiectivele:

Obiectivele generale si specifice ale proiectului, se refera la:

Ø punerea la punct a metodologiei privind diagnosticul neosporozei la bovine in Romania

o dezvoltarea si evaluarea unor metodologii de diagnostic in neosporoza la bovine

o propunerea unui protocol standard pentru diagnostic la vaca, avorton sau nou-nascut

Ø realizarea unui studiu epidemiologic privind neosporoza la bovine si caine in Romania

o realizarea unui screening serologic privind neosporoza la vaci de lapte din Romania

o identificarea infectiei cu N. caninum la avortoni proveniti de la vaci

o evaluarea impactului economic al afectiunii la nivel local si regional

o determinarea impactului N. caninum ca agent abortiv la vaci si determinarea riscului asociat seropozitivitatii unui animal.

Ø studiul mecanismelor patogenetice si imunologice in neosporoza naturala si experimentala

o definirea factorilor responsabili de reactivarea si transferul vertical al infectiei de la mama la fat

o punerea la punct a modelelor experimentale murin, gerbil si caprin de neosporoza congenitala

o studiul raspunsului imun si a productiei de chisturi tisulare la Soricei si gerbili infectati experimental cu tachizoiti de N. caninum;

o raspunsul imun si recunoasterea antigenica la oi gestante infectate experimental cu N. caninum in forma acuta si cronica de boala;

Ø studiul aspectelor privind relatia intre parazit si caine, gazda definitiva.

o stabilirea prevalentei bolii intestinale la caine prin metode coproscopice;

o determinarea pozitivitatii infectiei sistemice la caini, prim metode serologice.

e. Instituţia coordonatoare:

University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca Romania

Str. Calea Manastur nr 3-5 Cluj-Napoca Romania 400372

Tel: +4 0264 596384 Fax: +4 0264 593792

f. Componenţa consorţiului:

Consortiul este format din trei institutii, doua institutii de invatamant superior si o institutie privata, care are in obiectul principal de activitate si cercetarea.

Coordonatorul este: Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca; P1 este Societatea Naţională ”Institutul Pasteur” Sa Bucureşti, iar P2 este Universitatea De Ştiinţe Agricole Şi Medicină Veterinară Bucureşti.

Consortiul are un director de proiect si cate un responsabil proiect pentru fiecare institutie partenera. De asemenea, fiecare partener din consortiu are o echipa de cercetatori, coordonata de responsabili de proiect, astfel, echipa CO este formata din 19 membri (5 cadre didactice medici veterinari cu experianta in domeniu, 2 cercetatori postdoctorali, 4 doctoranzi, 1 masterand, 1 economist, 1 gestionar baza de date, 1 student, 1 sociolog si 3 tehnicieni), echipa P1 este formata din 6 membri (cercetatori-medici veterinari, 1 chimist, 1 biochimist si 2 masteranzi), iar echipa P2: 10 membri (6 medici veterinari cadre didactice, 1 biolog, 1 economist si doi studenti ca administratori baza de date).

g. Autoritatea contractantă:

Centrul Naţional de Management Programe Bucureşti

h. Durata proiectului: 01.10.2008 – 30.09.2011

i. Activităţile şi responsabilitatea aferente fiecărui partener:

Realizarea acestui proiect implica colaborarea a doua institutii de invatamant superior si a unei institutii private, cu activitate de cercetare.

Activitate I.1 : Studiu bibliografic privind neosporoza la bovine, carnivore si alte specii de animale

Ø CO realizeaza un studiu bibliografic privind patologia abortigena la bovine, a rolului factorilor parazitari si evaluarea impactului economic produs de avorturile neosporidiene

Ø P1 realizeaza studiu bibliografic privind neosporoza la caine si alte specii de animale

Ø P2 Studiu bibliografic privind metodologiile de diagnostic in neosporoza

Activitate I.2: CO: Organizarea work-shop-ului: Metodologii actuale in diagnosticul protozoozelor abortigene majore la rumegatoare-toxoplasmoza si neosporoza

Activitatea II.1: Dezvolarea unei metodologii de intretinere ‘in vitro’ a unei suse de Neospora caninum

CO, P1

Activitatea II.2: Stabilirea si verificarea unor metodologii de diagnostic a neosporozei la bovine

Ø CO: ELISA

Ø P1: IFAT

Activitatea II.3: Verificarea si implementarea unor metodologii de izolare si identificare a N. caninum din tesuturi infectate (modele experimentale pe soricei)

Ø CO: izolare N. caninum pe culturi celulare si animale de laborator (soricei; gerbili)

Ø P1: PCR

Ø P2: imunohistochimie (IHC)

Activitatea III.1: Realizarea unui screening serologic la vaci prin metodele implementate (IFI, ELISA)

Ø CO nord-vestul tarii

Ø P1 centrul tarii

Ø P2 sudul tarii

Activitatea III.2: Studiu epidemiologic privind frecventa avorturilor produse de N. caninum la bovine din nord-vestul, centrul si sudul Romaniei

Ø CO: izolare N. caninum pe culturi celulare si animale de laborator (soricei si gerbili)

Ø P1: PCR

Ø P2: IHC si histologie

Activitatea IV.1: Studiul raspunsului imun si a reactivitatii tisulare la unele animale de laborator infectate experimental cu tachizoiti de N. caninum

Ø CO: pe model caprin

Ø P1: pe model murin

Ø P2: pe gerbili

Activitatea V.1: Descrierea unor aspecte patogenetice si anatomo-clinice la vitei infectati natural cu N. caninum

Ø CO: Descrie aspectele anatomo-clinice si hematologice in neosporoza naturala la vitei nou-nascuti

Ø P1: Descrie parametrii biochimici sanguini si enzimatici in infectia naturala cu N. caninum la vitei

Ø P2: Evalueaza reactivitatea tisulara in neosporoza neonatala la vitei prin utilizarea tehnicilor histologice si imunohistochimice

Activitatea V.2: Studiul imunitatii mediate celular si umoral la vitei infectati natural

Ø CO: Studiul imunitatii mediate umoral la vitei cu neosporoza congenitala

Ø P1: Studiul imunitatii mediate celular la vitei cu neosporoza congenitala

Activitatea VI.1: Diagnosticul coproscopic al coccidiozelor intestinale la caini din zone urbane si rurale in Romania

Ø CO: in nord-vestul tarii

Ø P1: in centrul tarii

Ø P2: in sudul tarii

Activitatea VI.2: Diagnosticul serologic al infectiei cu N. caninum prin utilizarea metodelor de imunofluorescenta (IFAT) si imunoenzimatica ELISA la caini din zone urbane si rurale in Romania

Ø CO: in nord-vestul tarii

Ø P1: in centrul tarii

Ø P2: in sudul tarii

Activitatea VI.3: Reproducerea experimentala a neosporozei intestinale la caine si descrierea aspectelor patogenetice, anatomo-clinice si imunologice

Ø CO: Descrie aspectele patogenetice, clinice si anatomopatologice in neosporoza experimentala intestinala la caine

Ø P1: Descriere aspectele imunologice in neosporoza experimentala intestinala la caine

Ø P2: Descriere aspectele histopatologice in neosporoza experimentala intestinala la caine

Activitatea VI.4: Elaborarea unei strategii de supraveghere, diagnostic si prevenire a neosporozei la bovine si caine in Romania CO, P1, P2.

- modalitatile de valorificare a rezultatelor – potentiali beneficiari

j. Bugetul proiectului

Institutia	2008		2009		2010		2011		Total
	B	C	B	C	B	C	B	C
CO Universitatea De Stiinte Agricole Si Medicina Veterinara Cluj-Napoca	0	0	283150	0	318329	0	397927	0	1000000
P1 Societatea Nationala ‘Institutul Pasteur’ Sa Bucuresti	0	0	144479	20000	200340	20000	205181	10000	600000
P2 Universitatea De Stiinte Agricole Si Medicina Veterinara Bucuresti	0	0	143877	0	80737	0	225386	0	450000
Total proiect	0	0	571506	20000	600000	20000	828494	10000	2050000

k. Rezultate obţinute Etapa I/2009

DESCRIEREA ŞTIINŢIFICĂ ŞI TEHNICĂ

Introducere

Neospora caninum este un protozoar care a fost identificat pentru prima dată ca fiind o cauză a paraliziei canine. Asocierea acestui parazit cu avorturile la bovine l-au transformat intr-o grijă a întregii comunităţi de crescători de vite.

Prima raportare a neosporei a fost sub numele de protozoar “Toxoplasma-like” de către Bjerkas şi col. în 1984 care au observat encefalomielite şi miozite, la câinii cu vârste cuprinse între 2-6 luni cu afecţiuni neurologice şi care au descoperit leziuni similare celor produse de Toxoplasma gondii în sistemul nervos central şi muşchi, fără ca animalele testate să aibă si anticorpi specifici faţă de Toxoplasma gondii. În 1988, un parazit similar a fost descoperit la 10 câini in SUA şi a fost denumit N. caninum, iar N. caninum a fost decoperit şi în studiile efectuate retrospectiv pe câini care au murit în 1957 şi 1958 în SUA. Din 1988 avorturile şi alte simptome datorate parazitului Neospora caninum au fost observate la bovine din Europa, America, Asia, Australia şi Africa.

Aceasta boală a fost diagnosticată la o gamă mare de gazde, cum ar fi: pisicile, oile, cainii, caprele, caii si bovinele, cu diferite semne clinice. De asemenea, serologic, a fost diagnosticată la bivoli, cămile, vulpi si canidele salbatice si la primate. Nu au fost, in schimb, pană acum, detectaţi anticorpi specifici la oameni.

În SUA, Europa şi în multe alte ţări din lume Neospora caninum reprezinta principala cauza a avorturilor de origine infectioasa la bovine si a pierderilor fetale, insa poate cauza, de asemenea, paralizii si moarte la caini si mortalitate neonatala si avorturi la capre, oi si cai (Hemphill şi Gottstein, 2000).

Neosporoza este determinată de un parazit protozoar care face parte din: Domeniul: Eukaryota, Regnul: Protista, Subregn: Chromoalveolata, Philum: Apicomplexa, Clasa: Conoidasida, Subclasa: Coccidiasina, Ordinul: Eucoccidiorida, Subordin: Eimeriorina, Familia: Sarcocystiidae, Genul: Neospora.

Dintre stadiile evolutive ale acestui parazit, cele care prezintă importanţa cea mai mare sunt: oochisturile, tachizoiţii, bradizoiţii şi chisturile tisulare.

Oochisturile de N. caninum au dimensiuni de aproximativ 10x12 μm şi sunt excretate în fecalele câinilor sub formă nesporulată. În mediul exterior are loc sporularea astfel încât, fiecare oochist conţine doi sporochişti, fiecare dintre aceştia conţinând la rândul său patru sporozoiţi, fiecare cu o dimensiune de aproximativ 6,5x2μm (Lindsay şi col., 1999) (Fig. 4.1.3). Numărul de oochisturi eliminate de câinii infectaţi natural este în mod normal foarte mic (Basso şi col., 2001a; Slapeta şi col., 2002). Experimental, câinii au eliminat oochisturi după ce au fost hrăniţi cu ţesuturi de la bovine infectate natural (Dijkstra şi col., 2001), de la bivoli (Rodrigues şi col., 2004) şi de la căprioare (Gondim şi col., 2005).

Tachizoiţii şi bradizoiţii (Fig. 4.1.1) sunt întâlniţi în ţesuturile gazdelor infectate (definitive şi intermediare). Tachizoiţii au formă alungită cu dimensiuni aproximative de 2 x 6 μm şi au un nucleu central, dar lipsesc granulele de amilopectină, aspect care îi deosebeşte de bradizoiţi. Se multiplică rapid în interiorul celulelor şi pot infecta mai multe tipuri de celule printre care neuroni, celule endoteliale vasculare, miocite, hepatocite, celule renale, macrofage şi trofoblaşti placentari (Barr şi col., 1995; Dubey şi col., 2002).

Bradizoiţii sunt stadii închistate, care se multiplică încet. Aceştia sunt subţiri şi măsoară aproximativ 6,5 x 1,5 μm (Dubey şi col., 2004), au un nucleu situat terminal şi conţin câteva granule de amilopectină care se colorează în roşu prin coloraţie PAS. Bradizoiţii pot fi deosebiţi de tachizoiţi prin etichetare imunohistochimică cu Ac bradizoit-specifici (BAG-1) (McAllister şi col., 1996). Părerea generală este că parazitul persistă sub formă de bradizoiţi (chisturi tisulare) în ţesuturile bovine, cu toate că aceste chisturi nu au fost observate în secţiuni histologice de la animale adulte infectate. Cu toate acestea, N. caninum a fost izolat din creierul a două vaci clinic sănătoase care au fătat viţei infectaţi (Sawada şi col., 2000; Okeoma şi col., 2004).

Chisturile tisulare pot varia foarte mult în dimensiune, depinzând de numărul de bradizoiţi din ele (Fig. 4.1.4). La câini s-au identificat chisturi de până la 107 μm în diametru şi cu un perete chistal de 4 μm (Dubey şi col., 2002). În ţesuturile bovine şi la viţeii infectaţi congenital chisturile tisulare au fost găsite în creier şi măduva spinării şi foarte rar sunt mai mari de 50 μm în diametru şi au un perete cu grosime de maxim 2,5 μm (Dubey şi col., 1989; Barr şi col., 1991a, b). Totuşi, în chisturile tisulare este greu de identificat stadiul parazitar, tachizoit sau bradizoit, dacă acestea au fost colorate HE deoarece uneori, N. caninum poate forma grupuri mari de tachizoiţi în timp ce în alte secţiuni grosimea peretelui este prea mică şi acesta nu poate fi indentificat (Dubey şi col., 2002).

Stadiile schizogonice şi gametogonice nu au fost încă observate, deşi formaţiuni asemănătoare schizonţilor au fost observate pe culturi celulare însămânţate cu bradizoiţi izolaţi din creierul unor câini infectaţi natural (Dubey şi col., 2004).

Figura 4.1.1: Stadii ale ciclului biologic a lui Neospora caninum: tachizoiţi în vacuole parazitofore

Figura 4.1.2: Bradizoiţi - în interiorul chistului

Figura 4.1.3: Oochist cu sporozoiţi

Fig. 4.1.4.: Chist tisular - Neospora caninum

(pcwww.liv.ac.uk/testapet/Neospora_9.htm)

Oochisturile de N. caninum sunt excretate sub formă nesporulată odată cu fecalele câinilor. Oochisturile sporulează în mediul exterior în aproximativ 24 de ore (Lindsay şi col., 1999 ). În acest moment se cunosc foarte puţine date legat de frecvenţa eliminărilor de oochisturi, despre viabilitatea acestora şi despre rezistenţa oochisturilor în mediul exterior. Din cauza strânsei relaţii dintre acest parazit şi T. gondii se consideră că rezistenţa în exterior a N. caninum este asemănătoare cu cea a oocisturilor de T. gondii (Dubey, 2004).

S-au identificat foarte puţine oochisturi eliminate de către câini infectaţi în mod natural (Basso şi col., 2001a; Slapeta şi col., 2002; McGarry şi col., 2003).

Experimental, câinii au eliminat oochisturi după ce au fost hrăniţi cu ţesuturi de la bovine infectate natural (Dijkstra şi col., 2001b), de la bivoli (Rodrigues şi col., 2004) şi căprioare (Gondim şi col., 2005).

La bovine, infecţia primară din sursă exogenă se realizează prin ingerarea de oochisturi sporulate (eliminate de câini sau coioţi) odată cu furajele sau apa. La nivelul intestinului subţire aceste oochisturi exchistează, fiecare oochist eliberând câte 8 sporozoiţi, fază care se desfăşoară asemănător toxoplasmozei ovine (Buxton, 2002). Sporozoiţii parazitează epiteliul intestinal, se transformă în tachizoiţi şi demarează procese de multiplicare endocelulară, posibil la nivelul limfonodulilor mezenterici. De aici tachizoiţii pătrund în sânge, necunoscându-se în ce măsură aceste forme vegetative se localizează intracelular sau sunt libere. Ca urmare a parazitemiei, formele parazitare sunt diseminate sistemic contaminând diverse organe, inclusiv uterul.

La bovine atât trasmiterea orizontală cât şi cea verticală joacă un rol important pentru menţinerea infecţiei şi sunt vitale pentru supravieţuirea parazitului. Transmiterea orizontală are loc când bovinele ingeră oochisturi sporulate. Transmiterea verticală este responsabilă pentru răspândirea infecţiei de la o vacă infectată persistent la progeniturile sale în timpul gestaţiei (Fig. 5). Transmiterea postnatală şi transmiterea congenitală sunt termeni alternativi pentru transmiterea orizontală, respectiv cea verticală. Recent s-au propus termenii transmitere transplacentară exogenă şi transmitere transplacentară endogenă pentru a descrie mai bine originea şi calea de infecţie a fetustului (Trees şi Williams, 2005).

Fig. 4.1.5: Ciclul biologic al parazitului Neospora caninum
(www.forschung3r.ch/fr/publications)

Transmiterea transplacentară exogenă are loc după o infecţie primară cu oochisturi a unei vaci gestante, în timp ce transmiterea transplacentară endogenă are loc la o vacă infectată persistent după reactivarea infecţiei în timpul gestaţiei. Transmiterea verticală (transplacentară endogenă) poate duce la avort, dar de cele mai multe ori duce la fătarea de viţei infectaţi congenital, sănătoşi clinic (Pare şi col., 1996; Andreson şi col., 1997; Schares şi col., 1998; Davison şi col., 1999a). Transmiterea verticală contribuie semnificativ la persitenţa infecţiei în efectiv prin propagarea infecţiei la generaţiile următoare (Bjorkman şi col., 1996; Anderson şi col., 1997; Schares şi col., 1998; Wouda şi col., 1998). Bovinele pot rămâne infectate toată viaţa (Trees şi col., 1999) şi pot transmite parazitul progeniturilor lor de-a lungul a mai multor generaţii succesive (Fioretti şi col., 2003), sau în mod intermitent (Boulton şi col., 1995; Wouda şi col., 198; Guy şi col., 2001).

Rata detectării infecţiilor congenitale variază, cu valori de 40,7% (Pan şi col., 2004), 44% (Bergeron şi col., 2000), 63,7% (Romero şi Frankena, 2003), 73% (Dijkstra şi col., 2003), 81% (Pare şi col., 1996), 85% (Bjorkman şi col., 2003), 93% (Schares şi col., 1998) şi 95% (Davison şi col., 1999a).

În prezent, se pare că transmiterea „de la vacă la vacă” a N caninum nu are loc (Andreson şi col., 1997).

Teoretic, N. caninum poate fi excretat prin lapte sau secreţii uterine. Transmiterea transgalactogenă a tachizoiţilor sau ingerarea de membrane fetale care conţin tachizoiţi pot contribui la o astfel de infecţie (Schares şi col., 1998; Uggla şi col., 1998; Davison şi col., 2001), dar se pare că aceste căi de transmitere au importanţă redusă.

Este foarte puţin posibil ca N. caninum să se transmită veneric sau prin embriotransfer. Acesta din urmă este recomandat de către Baillargeon şi col. (2001) ca măsură de control a transmiterii transplacentare endogene. În plus, se pare că embrionii bovini expuşi tachizoiţilor de N. caninum înainte de a fi implantaţi sunt rezistenţi la invazia parazitară (Bielanski şi col., 2002).

Cu toate că s-a identificat ADN de N. caninum în sperma taurilor expuşi în mod natural (Ortega-Mora şi col., 2003; Caetano-da-Silva şi col., 2004; Ferre şi col., 2005), rezultatele sugerează că paraziţi vibili apar foarte rar şi dacă apar, aceştia sunt în număr foarte mic. Deci, transmiterea venerică prezintă foarte puţină importanţă.

Modul de infectare a câinilor nu se cunoaşte încă. Eventualele animale mici care ar putea fi consumate sau vânate de către câini nu au fost identificate ca fiind purtătoare de N. caninum. Consumul de fetuşi bovini avortaţi nu pare a fi o cale care să reprezinte un procent important în metodele de transmitere. Consumul de învelitori fetale infectate poate reprezenta o modalitate de infecţie a câinilor, deoarece parazitul a fost identificat la nivelul placentei infectate natural, iar câinii care au fost hrăniţi cu astfel de placente au eliminat mai apoi oochisturi.

4.2. Studiu bibliografic privind neosporoza la animale

4.2.1. Studiu bibliografic privind patologia abortigenă la bovine, a rolului factorilor parazitari şi evaluarea impactului economic produs de avorturile neosporidiene – CO

4.2.1.1. Avorturile de natură virală la bovine

BVD-MD (Diareea virală bovină – boala mucoaselor)

BVD/MD este o boală virală produsă de virusul diareei bovine (Pestivirus din familia Togaviridae - BVDV) întâlnită şi la noi în ţară. Există mai multe forme de manifestare, depinzând de timpul de la transmitere, tulpina de virus infectant şi statusul imun al animalului infectat. Manifestările pot fi respitatorii, tulburări reproductive, alimentare sau cutanate. Bovinele susceptibile infecţiei pot fi de orice rasă, vârstă sau sex. Principala sursă de infecţie o reprezintă animalele infectate. Acestea elimină virusul prin excreţii şi secreţii. BVDV se poate transmite transplacentar. Infecţia transplacentară cu tulpini virulente determină moartea embrionară, resorbţia fetusului sau mumifierea acestuia. Dacă infecţia are loc la mijlocul gestaţiei, atunci pot să apară avortul, fătarea de viţei morţi sau fătarea de viţei slab dezvoltaţi care mor la câteva zile după fătare, se mai pot observa hipoplazia sau defecte oculare (Fraser şi col., 1991). Dacă infectarea are loc în ultimul stadiu al gestaţiei aceste semne clinice pot să lipsească deoarece viţelul are un sistem imun suficient de dezvoltat pentru a reacţiona la prezenţa virusului în organism. Aceşti viţei pot să devină infectaţi subclinic, în funcţie de sistemul lor imunitar. Virusul se multiplică la nivelul enterocitelor, dar şi la nivelul leucocitelor, ceea ce determină leucopenie pentru o perioadă de una sau două săptămâni post-infectant.

Diagnosticul la animale individuale se face în urma izolării virusului din probe de sânge recoltate de EDTA sau din tampoane nazale, prin identificarea anticorpilor în probe de ser, sau în urma necropsiei la care se observă eroziuni la nivelul tractului digestiv (Bezek, 1995). Este recomandată testarea întregului efectiv în momentul în care se suspectă prezenţa unui animal infectat cu BVDV. Pentru acest lucru este necesară testarea a unui număr minim de 10 seruri provenite de la animale cu vârste între 6 şi 24 de luni (Franck, 1994 ). Dacă se identifică prezenţa anticorpilor este necesară identificarea animalelor eliminatoare şi îndepărtarea lor din efectiv şi testarea tuturor animalelor cu o vârstă mai mică de 3 ani. Diagnosticul diferenţial se va face faţă de: IBR, viroza respiratorie sinciţială bovină, bronhopneumonia enzootică infecţioasă bovină, stomatita veziculoasă, salmoneloza, febra catarală malignă, febra aftoasă, paratuberculoza şi pesta bovină.

Este esenţială evaluarea statusului imun al efectivului şi a prevalenţei bolii în cadrul efectivului înainte de orice program de control. Pentru acest lucru este necesară testarea a unui număr minim de 10 seruri provenite de la animale cu vârste între 6 şi 24 de luni (Quaife, 1995). Dacă se identifică prezenţa anticorpilor este necesară identificarea animalelor eliminatoare şi îndepărtarea lor din efectiv şi testarea tuturor animalelor cu o vârstă mai mică de 3 ani. Fără eliminarea animalelor infectate vaccinarea nu va avea efectul dorit. Chiar şi un singur animal infectat va prezenta risc pentru efectiv.

IBR-IPV (Rinotraheita infecţioasă bovină – vulvo-vaginita pustuloasă )

Este o viroză produsă de herpesvirusul bovin 1 (BHV 1) care afectează un număr mare de efective din mai multe ţări ale lumii. Foarte puţine ţări sunt considerate indemne de IBR-IPV. Multe dintre animalele achiziţionate nu prezintă semne de infecţie deoarece virusul are capacitatea de a se retrage la nivelul ganglionului trigemen (Wren, 1997). Acesta se reactivează în momentul în care îşi face apariţia un factor stresor cum ar fi transportul sau schimbarea mediului înconjurător. Astfel, animalele stresate încep să elimine virusul odată cu excreţiile nazale, oculare, sau, în unele cazuri, vaginale. După câteva zile întregul efectiv poate deveni infectat. Morbiditatea poate ajunge până la 100%, în timp ce mortalitatea atinge valori ce variază între 2 şi 12 %.

IBR este caracterizată de hipertermie, inflamaţia oglinzii botului şi înroşirea acesteia, fapt ce a determinat denumirea bolii de „ Boala nasului roşu”. Se mai poate observa prezenţa unui jetaj seros care treptat se transformă în jetaj purulent. Mucoasa respiratorie prezintă focare mici depigmentate şi pustule. De asemenea, animalele pot prezenta conjunctivită, iar producţia de lapte poate să scadă. Mai pot să apară avorturi în orice stadiu de gestaţie, de obicei la 3-8 săptămâni după apariţia semnelor respiratorii.

IPV este un alt tip de manifestare a infecţiei. Semnele clinice sunt localizate la nivelul tractului genital şi se exprimă prin vulvovaginită. Se pot observa pustule la nivelul mucoasei şi excreţii mucopurulente. Aceste simptome pot fi însoţite de tulburări temporare de fertilitate. Semnle clinice se pot remite în câteva săptămâni, dar animalul va rămâne purtător şi eliminator toată viaţa (Larson, 1996).

Diagnosticul poate fi confirmat prin izolarea virusului din tampoane nazale sau conjunctivale combinată cu teste serologice. La necropsie se identifică necroze focale la nivelul ficatului şi a rinichilor. Diagnosticul în efectiv se realizează cu ajutorul testelor serologice, sau prin testarea laptelui de colctură. Prezenţa anticorpilor sugerează existenţa în efectiv a unei infecţii latente. Evenimentele stresante pot duce la reactivarea bolii (Thiry, 1997).

Diagnostic diferenţial se face faţă de bronhopneumonia enzootică, febra catarală malignă, BVD/MD, febra de transport.

4.2.1.2. Avorturile de natură bacteriană la bovine

Bruceloza

Bruceloza bovină este o boală infecto-contagioasă produsă obişnuit de Brucella abortus care afectează organele genitale şi se manifestă în principal prin avorturi şi tulburări de reproducţie. Bovinele se infectează şi fac boala în mod obişnuit cu Br. abortus, dar se pot infecta uneori şi cu Br. melitensis.

Bovinele adulte ajunse la maturitate sexuală sunt mai sensibile decât tineretul, femelele sunt mai sensibile decât masculii, iar femelele gestante sunt mai sensibile decât femelele negestante. Bovinele sunt socotite nu numai cele mai receptive la infecţia cu Br. abortus, dar şi singurele gazde şi rezervor natural de germeni în natură, a acestei specii (Dubois, 1993).

Într-un efectiv de bovine indemn, bruceloza este introdusă aproape invariabil prin achiziţionarea de animale infectate, dar aparent sănătoase clinic. Aceste animale, de cele mai multe ori, nu sunt eliminatoare de germeni. Cu ocazia gestaţiei următoare, în momentul expulzării produsului de concepţie, indiferent dacă acesta este avortat, fătat la termen sau prematur, se elimină cantităţi mari de bacterii (Jubb, 1993).

În cadrul unui efectiv infectat infecţia se transmite de la animalul bolnav la animalul sănătos, direct sau indirect, pe cale digestivă, odată cu apa sau furajele. Multiplicarea germenilor este reactivată când intervine starea de gestaţie, brucelele având o afinitate specială pentru uterul gestant, placentă şi ţesuturile fetale datorită conţinutului bogat în erithritol al acestora, faţă de care brucelele prezintă chimiotactism. Rezultatul multiplicării brucelelor la nivelul placentoamelor este inflamaţia necrotico-purulentă, cu reducerea legăturilor dintre mamă şi făt, a aportului nutriţional şi de oxigen, având drept consecinţă moartea produsului de concepţie şi avortul. Dacă infecţia are loc într-un stadiu mai avansat al gestaţiei, iar fenomenul inflamator-necrotic cuprinde o suprafaţă cotiledonară mai redusă, gestaţia poate fi dusă la termen, sau aproape de termen, dar nou-născutul este subponderal, neviabil (Nielson, 1999). Mai ales în cazul avorturilor mai tardive are loc retenţia totală sau parţială a placentei, din cauză că, în paralel cu inflamaţia necrotică a placentoamelor are loc şi o proliferare conjunctivă, care determină "sudarea" carunculilor uterini de cotiledoanele placentare.

Principala manifestare a brucelozei la vaci este avortul. De cele mai multe ori avortul se produce în ultima treime a perioadei de gestaţie. Uneori avortul este mai timpuriu, în ultimele 3-5 luni de gestaţie, sau gestaţia este dusă până în preajma termenului normal de fătare, când se produce fatarea prematură de viţei subdezvoltaţi şi neviabili. În cazul avorturilor mai timpurii se elimină de regulă fetusul mort, cu învelitori cu tot, animalele nu se resimt prea mult şi la însămânţarca făcută la un nou ciclu pot să rămână din nou gestante, de cele mai multe ori fără să mai avorteze. Alteori avortul este urmat de infecunditate temporară sau definitivă. Dacă avortul se produce într-o fază avansată a gestaţiei se produc frecvent retenţii placentare care, pe lângă perturbarea ciclului hormonal se soldează şi cu complicaţii endometriale de suprainfecţie, respectiv cu stări septicotoxiemie.

Diseminarea germenilor pe cale limfatică determină inflamaţia acută a limfonodurilor, care apar tumefiate, cu medulara slab delimitată de corticală şi cu prezenţa de hemoragii discrete sau întinse. Sinusurile sunt infiltrate cu neutrofile, eozinofile şi plasmocite (Sarcă, 1996).

Leziunile principale, având caracter inflamator necrotic, sunt localizate în special la nivelul uterului gestant, a placentei, testiculelor şi veziculelor seminale, precum şi în limfonoduri. Unele cotiledoane în întregime, altele parţial, apar necrozate, acoperite cu un exsudat vâscos, de culoare maronie. Fetusul este edemaţiat, cu lichid serosangvinolent în ţesutul conjunctiv subcutanat şi în cavităţile seroase, uneori cu focare necrotice şi granuloame cu celule gigant în ficat, splină, rinichi, pulmoni şi limfonoduri

Diagnostic. La bovine bruceloza trebuie suspicionată ori de câte ori apar avorturi, mai ales dacă sunt în a doua jumătate a gestaţiei, iar la tauri ori de câte ori apar orhite, însoţite sau nu de manifestări: retenţii placentare, tulburări de ciclu, artrite, bursite etc (Volintir, 1975). Diagnosticul diferenţial trebuie să aibă în vedere celelalte avorturi infecţioase (campilobacterian, salmonelic, chlamydian, listeric, leptospiric, rickettsian, IBR şi altele), precum şi avorturile neinfecţioase (mecanice, toxice, alimentare şi parazitare, în special trichomonotic) şi avorturile micotice.

Pentru confirmare se recurge în toate cazurile la examenul de laborator care urmăreşte două obiective: punerea în evidenţă a agentului etiologic şi punerea în evidenţă a anticorpilor.

Campylobacterioza genitală bovină (vibrioza genitală a taurinelor)

Campylobacterioza genitală a taurinelor este o boală infecţioasă caracterizată clinic prin afectarea organelor genitale, avort, sterilitate temporară sau permanentă. Boala produce pierderi prin: avorturi fetale, infecunditate (avorturi ovulare şi embrionare), complicaţii după avort (femele compromise adesea pentru reproducţie), scăderea greutăţii şi productivităţii, scurtarea ciclului normal de reproducţie şi producţie. Morbiditatea exprimată prin avort fetal de natură campylobacteriană este cuprinsă între 5-25% (Alderton şi col., 1992).

Agentul cauzal al bolii este Campylobacter rfetus ssp. venerealis, o bacterie curbată şi spiralată (forma literei „S"). În cadrul speciei se descriu două subspecii: Campylobacter fetus spp. venerealis şi Campylobacter fetus ssp. fetus.

Campylobacterioza afectează vacile tinere (2-3 ani), taurii şi mult mai rar, femelele impubere. Este o boală transmisibilă aproape exclusiv prin montă sau însămânţări artificiale. Taurii infectaţi, fără semne clinice evidente, transmit boala vacii prin actul montei timp îndelungat (6-8 ani). Vacile rămân, după avort, purtătoare şi eliminatoare de germeni timp de 3-4 luni, rareori până la 10 luni (Gebhart, 1985).

Dinamica epizootică este diferită, în funcţie de vechimea bolii în efectiv. Astfel, incidenţa maximă a infecţiei se constată în primul an de la pătrunderea ei într-un efectiv. După apariţia infecţiei şi mersul enzootic al avorturilor şi infecundităţii, urmează o perioadă de mai mulţi ani, în care morbiditatea scade, iar avorturile sunt sporadice; infecţia trece în stare de latenţă. Totuşi, această formă latentă, cu aspect deosebit de insidios este considerată drept cauză a cel puţin 15-30% din cazurile de sterilitate (Nielsen şi col., 1997).

La femele debutul poate trece neobservat sau boala se manifestă printr-o vaginită şi cervicită catarală. Mucoasa vaginală devine roşie, tumefiată şi prezintă nişte formaţiuni nodulare proeminente, mai ales în jurul clitorisului. Ulterior, leziunile îmbracă aspectul mucopurulent. La femelele negestante, căldurile apar neregulat, cu întârziere, iar ciclul estral se prelungeşte până la 5-8 săptămâni (Tudoriu şi col, 1954).

La animalele gestante se produc avorturi între a 1-a şi a 8-a lună. În general, avortul apare în a 2-a jumătate a gestaţiei mai frecvent în a 5-a lună. Avorturile precoce pot trece neobservate. După avorturile târzii şi chiar după fatările normale se produc retenţii placentare, metrite şi sterilitate. Dacă gestaţia este dusă până la capăt, fetuşii pot fi debili şi neviabili.

Deşi se admite că după infecţie se instalează o stare de imunitate locală, totuşi, mai pot avea loc avorturi la mai multe gestaţii consecutive. Astfel, Grigore în 1963, semnalează câteva focare în care avortul campylobacterian s-a produs de 2-3 ori consecutiv.

Tabloul anatomopatologic. La femele se observă leziuni de vaginită şi cervicită catarală, uneori cu aspect purulent. În cazuri de avort se produc retenţii placentare şi endometrite, învelitorile fetale sunt edematiate, hemoragice si cu zone de necroze la nivelul cotiledoanelor. Avortonii sunt edemaţiaţi, cu hemoragii punctiforme subepicardice, lichide sero-hemoragice în cavităţi şi depozite de fibrină pe seroase.

Diagnosticul. Datele epizootologice, clinice şi anatomopatologice permit numai un diagnostic prezumtiv. Confirmarea suspiciunii de avort campylobacterian se face prin examen de laborator (bacterioscopic, bacteriologic, serologic). Punerea în evidenţă prin examen microscopic direct a germenului în cotiledoanele lezate, în conţinutul stomacal al avortonilor sau în alte organe este considerată drept criteriu sigur de diagnostic (Grigore şi col., 1963).

Examenul serologic permite identificarea anticorpilor aglutinanţi. Mucoaglutinarea, prin decelarea aglutininelor din mucusul vaginal este superioară seroaglutinării, mai ales ca metodă de supraveghere în masă. Reacţia este pozitivă după 60 de zile de la infecţie (Schultze, 1992).

Testul ELISA (imunoenzimatic) a fost folosit de Husu şi col., în 1991, în scopul detectării IgA-antigen specifice, din mucusul vaginal, după avortul cu Campylobacter fetus ssp. venerealis şi pare a fi util în diagnosticul bolii. Testul este mai sensibil decât testele de |glutinare ale mucusului vaginal, dar se utilizează pentru diagnosticul de efectiv şi mai puţin pentru diagnosticul individual.

Pentru decelarea infecţiei la taurii de reproducţie se poate folosi, cu foarte bune rezultate şi testul de imunofluorescenţă.

Diagnosticul diferenţial se face faţă de avorturile infecţioase: chlamydian, salmonelic, brucelic, listeric etc, sau de altă natură (parazitară, toxică, alimentară), numai prin investigaţii de laborator.

Profilaxia

Prevenirea bolii se bazează pe respectarea măsurilor nespecifice. Astfel, pentru păstrarea indemnităţii unui efectiv sunt necesare:

- precizarea naturii etiologice a oricărui avort;

-folosirea însămânţărilor artificiale cu material seminal de la tauri verificaţi în prealabil, indemni de infecţie;

- urmărirea permanentă şi riguroasă a activităţii taurilor, a montelor, fătărilor, avorturilor şi luarea de măsuri corespunzătoare în caz de repetări; - igiena taurilor în centrele de însămânţări;

- controlul taurilor din centrele de însămânţări artificiale de 4 ori pe an (trimestrial), iar al taurilor importaţi, de două ori la interval de 20 de zile, în perioada de carantină.

Imunoprofilaxia se poate face prin folosirea de vaccinuri vii, atenuate sau inactivate prin formol, fenol şi căldură.

Combatere

În cazul apariţiei avortului determinat de Campylobacter fetus ssp. venerealis, femelele care au avortat şi cele care prezintă afecţiuni ale sferei genitale se izolează şi se supun tratamentului pe cale intrauterină cu suspensie de antibiotice. Concomitent, antibioticul se administrează şi pe cale parenterală. Femelele astfel tratate vor fi reţinute de la montă timp de 3 luni.

Avortul chlamydian bovin

Avortul chlamydian al taurinelor denumit şi avortul epizootic, este o boală infecţioasă exprimată clinic prin avort, retenţii placentare şi, uneori, prin pneumonii şi enterite la viţei. Boala afectează vacile gestante, însă Chlamydophyla (Chlamydia) psittaci, serotipul WC a fost izolat şi de la bovine cu pneumopatii, enteropatii, encefalomielite, precum şi din fecalele animalelor sănătoase.

În declanşarea formelor clinice un rol important îl deţin factorii favorizanţi: alimentaţia dezechilibrată, deficitul de vitamine, condiţii necorespunzătoare de igienă, stresuri de transport etc. Infecţia poate evolua enzootic, determinând avortul la vacile gestante în 25 - 30% din cazuri (Luthgen, 1984).

Principala manifestare clinică este avortul, care apare brusc, fără semne prodromale. Avortul se produce mai ales în ultimele 3 luni de gestaţie. După avort se pot semnala retenţii placentare, metrite, scurgeri vaginale etc. Concomitent cu avortul femelelor gestante, frecvent se semnalează cazuri de pneumo şi enteropatii la viţei (Storz, 2004). De asemenea, în efectivele contaminate în afară de avorturi se înregistrează şi numeroase cazuri de fătări premature sau fătări la termen de viţei imaturi, cu debilitate congenitală, care măresc procentul de mortalitate postnatală. Frecvent se observă cazuri de eczemă a cozii şi a extremităţilor. După avort sau fătare nu se contată tulburări de reproducţie.

La necropsia avortonului se contată frecvent hemoragii pe mucoasa conjunctivală, mucoasa bucală şi traheală şi mai rar în alte organe. Uneori, se constată infiltraţia edematoasă a ţesutului conjunctiv subcutanat. Cele mai caracteristice leziuni se găsesc în ficat. Acesta este mărit în volum, cu suprafaţa neregulată şi friabil, de culoare de la roşu pal la portocaliu. Limfonodulii sunt măriţi şi edemaţiaţi. Invelitorile fetale prezintă leziuni necrotice.

Diagnosticul de certitudine se stabileşte numai prin examene de laborator, în care se vizează confirmarea infecţiei cu chlamydii şi excluderea concomitentă a celorlalte boli abortigene. Evidenţierea germenului în amprentele de pe suprafaţa cotiledoanelor lezate şi din mucusul de pe suprafaţa avortonilor confirmă avortul chlamydian. Germenii se pot pune în evidenţă după avort şi în secreţiile din endometrite şi vaginite.

Leptospiroza taurinelor

Este răspândită în toată lumea, dar mai mult în Australia, America, Asia, producând pierderi însemnate în special în ţările în care se practică creşterea extensivă. În tara noastră au fost semnalate relativ puţine focare de boală dar prin examene serologice s-a constatat că în unele zone până la 33% din bovine trec prin infecţii leptospirice, în marea majoritate a cazurilor infecţia fiind asimptomatică. L. interrogans, serovarurile pomona, grippotyphosa, urmate de icterohaemorrhagiae, canicola, serjoe ş.a. au fost considerate cele mai frecvente serotipuri de leptospire la taurine dar, în ultima vreme, serovarul hardjo a fost tot mai des semnalat.

La vacile cu gestaţie avansată este posibil avortul. Secreţia lactată scade, este colorată in roşu sau conţine cheaguri de sânge. Durata bolii este de 4-6 zile până la 10-15 zile. În formele cronice animalele bolnave prezintă semne discrete de anemie, icter, subfebrilitate şi hematurie. Animalele aflate în ultima treime a perioadei de gestaţie pot să avorteze. O bună parte din animale fac infecţii asimptomatice şi se pozitivează serologic.

Listerioza bovină

La bovine, listerioza a fost semnalată pentru prima oară de Mathews, în 1928.

Tabloul simptomatic este extrem de diferit, deosebindu-se forme: septicemice, nervoase şi abortigene.

Forma abortigenă, genitală se manifestă prin avort, în special la primipare. Avortul se produce în tot timpul gestaţiei, dar este mai frecvent între a 2-a şi a 7-a lună. Adesea se constată retenţia învelitorilor şi procese septice, produse de germeni de asociaţie. Diagnosticul se stabileşte întotdeauna prin examen bacteriologic. Insămânţările pe medii de cultură se fac din învelitori şi din avortoni, iar la vaci, din lapte (în caz de mamite) şi din sistemul nervos, în caz de encefalită.

Salmoneloza taurinelor

Infecţia salmonelică cu manifestare clinică se înregistrează la viţeii de peste o lună, excepţional la vârsta de peste o lună, excepţional la vârsta de 1-2 săptămâni şi cu o frecvenţă redusă la taurinele adulte. Salmoneloza primară la taurine este produsă de un număr restrâns de scrotipuri: S. typhimurium, S. dublin, S. enteritidis, S. rostok şi S. saint-paul.

S-a constatat că serotipul S. dublin este cel mai adaptat la taurine, care devin purtătoare de lungă durată sau chiar pentru întreaga viaţă. Totodată s-a stabilit că acest serotip are virulenţa crescută şi în consecinţă tendinţa ridicată la infecţii generalizate.

Incidenţa salmonelozei la taurine diferă da la o ţară la alta şi de la o zonă la alta, în funcţie de o serie de factori ecologici. Pentru ţara noastră se consideră că incidenţa bolii este mai ridicată în Transilvania (Popa, 1967). Taurinele adulte sunt excepţional afectate, însă pot fi purtătoare şi exeretoare de germeni. Rezistenţa la infecţia salmonelică a rumegătoarelor adulte s-a demonstrat că se datoreşte lichidului ruminal care conţine factori inhibitori pentru Salmonella (Chambers, 1979) şi care lipsesc la viţelul nou-născut.

La taurinele adulte boala evoluează acut sau cronic, ca enterită salmonelică cu simptomatologie în general asemănătoare celei descrise la viţei. Unele simptome particulare pot fi hipo sau agalaxia, avorturile tardive şi mamitele. Îmbolnăvirile apar în condiţii de rezistenţă scăzută, sub influenţa unor factori favorizanţi, cum sunt ploile reci, căldurile toride, transporturile epuizante, trecerea bruscă de la un regim alimentar la altul şi în special la scoaterea la păşune.

Diagnostic. Pentru confirmare, examenul bacteriologic este obligatoriu în toate cazurile. Acesta urmăreşte izolarea şi identificarea serotipului de Salmonella implicat în procesul infecţios. Diagnosticul diferenţial se face faţă de colibaciloză care apare în prima săptămână de viaţă, faţă de coccidioză, diagnosticabilă prin examen ovocoproscopic şi faţă de formele pulmonare (pasteurcloză, streptococic etc.) când hotărâtor este examenul bacteriologic.

4.2.1.3. Avorturile de natură parazitară la bovine

Trichomonoza taurinelor

Trichomonoza genitală a taurinelor, transmisibilă prin actul montei şi inseminare artificială cu material contaminat, se caracterizează prin inflamaţii utero-vaginale, avorturi, piometrită şi infecunditate la vaci; în evoluţie inaparentă clinic la tauri. Boala este produsă de Trichomonas foetus şi se întâlneşte pe întreg globul, cu prevalentă ridicată în zonele şi unităţile în care se practică monta naturală.

Trichomonaşii se dezvoltă obişnuit pe suprafaţa mucoasei şi glandelor, în secreţiile uterine cervicale şi vaginale. Dezvoltarea paraziţilor se face preferenţial în uter, unde infecţia persistă mai multe luni. La avorton se dezvoltă în cavitatea seroaselor şi în tubul digestiv, precum şi în lichidele şi învelitoarele fetale. La tauri se cultivă pe mucoasele furoului şi prepuţială, în pliurile mucoasei, protejaţi de resturile celulare. Uneori pătrund pe uretră şi căile superioare, până la veziculele seminale şi epididim. Trichomonaşii se hrănesc din componentele aflate în secreţii şi lichidele mucoaselor şi seroaselor.

Sursa principală de infecţie o reprezintă taurii cu forme asimptomatice, care rămân eliminatori de trichomonaşi (dacă nu sunt trataţi) timp de 18 luni sau mai mulţi ani şi, de asemenea, vacile cu infecţia organelor genitale, care durează în forme cronice circa 4 luni sau peste.

Contaminarea taurinelor se realizează în timpul montei sau prin inseminare cu material seminal contaminat, în care trichomonaşii supravieţuiesc la temperaturi de până la -179 C. Incidenţa bolii pe glob este variabilă, în unele ferme este slabă (5,8%), în altele până la 65% (Goodger şi Skirrow, 1986; Şuteu şi col., 1978).

Boala evoluează enzootic în fermele de vaci defectuos întreţinute, unde se folosesc reproducători necontrolaţi sanitar, mai ales la animale pe păşune. Riscul contaminării prin aşternut murdărit cu secreţii vaginale de la bolnavi la animalele învecinate este redus, dar posibil.

Receptivitatea este remarcabilă la juninci, urmate de vaci, în timp ce taurii sunt mai rezistenţi, obişnuit suportând infecţia sub formă latentă de lungă durată. Incidenţa creşte proporţional cu vârsta taurilor, astfel că tăuraşii sunt mai rar infectaţi (Fazakas, 1989).

Modificări morfopatologice. La vacă se constată vaginită catarală, uneori granuloasă, cervicită şi endometrită, care evoluează singulare sau împreună, consecutiv avortului; dacă învelitorile nu sunt eliminate se produce piometrită. Avortonul este palid, cu ţesutul conjunctiv gelatinos, cu lichide în cavităţile seroaselor. Învelitorile fetale sunt anemice şi cu focare de necroză - placentită necrotică. Când fetusul este reţinut mort în uter, se produce macerarea lui şi a învelitorilor fetale, rezultând magmă purulentă, cu resturi tisulare, necrozate. La cazurile cronice, vaginită este granuloasă hiperplastică, uterul cu mucoasa în-groşată şi pliată. La tauri, se produc balanopostită şi uretrită exsudative şi necrotice.

Simptomatologie. Exprimată mai grav la juninci şi vaci, este benignă la tauri. La vaci, perioada de incubaţie este de 3-4 zile, după care se observă secreţii vaginale albicioase, sticloase (ca şi albuşul de ou), conţinând grunji cenuşii, care durează 10-14 zile, apoi secreţiile se reduc (vaginită granuloasă) (Mehlhorn, 1986). Vacile au mişcări frecvente din coadă, dar starea generală nu este modificată. Căldurile se repetă la interval neregulat, de obicei întârziate, şi produc infecunditate. Când se produce fecundaţia, pot avea loc avorturi embrionare, complicate cu endometrită care evoluează cronic, cu scurgeri vizibile în timpul estrusului, care este neregulat. Avorturile pot să apară şi în faza fetală, la 3-5 luni, când avortonii sunt expulzaţi cu învelitorile fetale. Când nu are loc expulzarea fetusului, se produce mumifierea şi piometrită. La deschiderea colului uterin, în timpul căldurilor, se scurg secreţii abundente, cu miros respingător. La examenul transrectal, dimensiunea crescută a uterului, consistenţa şi fluctuaţia lichidului au semnificaţie diagnostică. Piometrita trenează timp îndelungat, dacă nu se intervine medicamentos. Tulburările clinice la juninci sunt mai grave.

Alteori, simptomele se atenuează şi animalele vindecate spontan în 2-3 săptămâni rămân purtătoare şi eliminatoare de trichomonaşi.

Diagnosticul. Clinic, se suspectează la vaci şi juninci cu: avorturi în primele 4 luni de gestaţie, fără retenţie placentară, călduri neregulate infecunde; piome-trită şi scurgeri muco-purulente. Diagnosticul de laborator este de certitudine şi constă în metode de identificare directă a trichomonaşilor, prin examenul microscopic al materialelor suspecte, şi cultural, prin însămânţarea din acest material pe medii selective.

Examenul microscopic la vaci se face din: scurgeri vaginale şi uterine. La avorton se recoltează lichide de la nivelul seroaselor - peritoneală, pericardică, pleurală - şi din intestin; din lichidele şi învelitorile fetale. Se impune ca examenul microscopic să fie efectuat în 24-48 ore din momentul expulzării.

Examenul este pozitiv în cazul când se observă flagelii şi prezenţa membranei ondulante, cu mişcări în valuri, propagate de la extremitatea anterioară. Prezenţa unor flagelaţi, ca Bodo foetus, cu 2 flageli şi fără de membrană ondulantă infirmă diagnosticul. Examenul microscopic direct negativ impune mai multe controale (3-6), repetabile la 4-6 zile ().

Diagnosticul prin metode de laborator indirecte serologice se recomandă în special pentru depistarea purtătorilor, taurilor şi vacilor cu infecţii subclinice. Se utilizează metodele de sero-aglutinare şi muco-aglutinare directă. Testul de muco-aglutinare se pretează la controlul femelelor.

Diagnostic diferenţial se face faţă de: avorturile din bruceloză - apar tardiv, cu retenţie placentară, în ultimele luni de gestaţie; vibrioză - avorturile se produc în toată perioada gestaţiei, cu retenţie placentară; avorturi fungice - tardive, cu leziuni necrotice placentare şi la avorton; endometrite bacteriene; vestibulo-vaginită granulomatoasă care afectează treimea posterioară a vaginului (Euzeby, 1986).

Toxoplasmoza

Definiţie. Toxoplasmoza, zoonoză parazitară cu implicaţii serioase sociale şi zootehnice, afectează mamiferele şi păsările domestice şi sălbatice, evoluând grav, cu avorturi, malformaţii congenitale, mortalitate şi sindroame nervos, respirator, digestiv la tineretul animal. Este o sporozooză cosmopolită produsă de Toxoplasma gondii.

Etiologie. Toxoplasma gondii este sporozoar din clasa Sporozoasida, ord. Eucocci-diorida, fam. Sarcocystidae, genul. Sub aspect evolutiv, este parazit diheteroxen.

Ciclul evolutiv se realizează prin intermediul a două tipuri de gazde. G.D. este formată în special de pisica domestică, dar mai pot fi pisica sălbatică, linxul european, jaguarul, pisica tigru, la care se dezvoltă fazele gametogonice. G.I. este reprezentată de toate speciile de mamifere şi păsări, în organismul cărora se derulează faza schizogonică (Dubey şi col., 1972; Frenkel şi col., 1970).

Gazdele intermediare se pot contamina în moduri diferite: pe cale bucală, prin ingerare de oochisturi, chisturi sau pseudochisturi (carnivore şi omnivore) odată cu alimentele (carne, ouă, vegetale) şi apa. Contaminarea se mai poate face transplacentar, congenital, când mama sau femelele animale se contaminează în timpul gestaţiei; pe cale genitală, când materialul seminal conţine forme vegetative, dovedită la berbec şi oaie; pe cale transcutanată, prin artropode hematofage.

Patogeneză. Toxoplasmoza, sporozooză de tip sistemic, poate pătrunde în cele mai diverse celule ale organismelor gazdă. La G.I. parazitează celulele nervoase, ale sistemului reticulo-endotelial, mononuclearele, miofibrilele, precum şi celulele parenchimatoase din diverse organe. Pătrunderea intracelulară este posibilă datorită motilităţii sporozoiţilor şi trofozoiţilor şi prin fagocitoză. Multiplicarea schizogonică determină procese de necrobioză, distrugeri celulare, cu afectarea limfoganglionilor regionali şi diseminare hematogenă în tot organismul. Efectele inflamatorii şi toxice sunt mai grave când sunt afectate ţesuturi importante: S.N.C., miocard, placentă, musculatură, pulmon ş.a.

Infecţiile congenitale sunt obişnuit însoţite de procese complexe, adesea incompatibile cu dezvoltarea embrio-fetală. Leziunile placentare favorizează trecerea trofozoiţilor şi dezvoltarea la embrion şi fetus. Infecţiile în perioada de organogeneză provoacă procese toxiinflamatorii, însoţite de dezvoltarea teratogenă, cu malformaţii ale organelor. Înmulţirea schizogonică la nivelul creierului şi formarea granuloamelor afectează irecuperabil unele zone determinând deficite neuro-psihice celor care supravieţuiesc. Invazia oculară determină retinită, irido-ciclite cu compromiterea văzului. Alteori, dezvoltarea intensă a toxoplasmelor afectează legăturile placentare pe suprafeţe întinse, încât se produce moartea ţesutului urmată de avort. Avorturile - dependent de momentul contaminării - se produc în diferite perioade de gestaţie.

Modificări morfopatologice. Spectrul lezional, deşi polimorf, este rezultanta unei infecţii sistemice cu modificări posibile în toate ţesuturile, organele, seroasele şi viscerele. Obişnuit leziunile primare sunt provocate de tachizoiţi care se multiplică determinând focare necrotice miliare diseminate în diverse organe: pulmon, ficat, miocard, creier, musculatură. Bronhopneumonie fibrinoasă, necrotică, splenomegalie şi adenomegalie regională, degenerescentă hepatică, gastrită şi ulcere gastro-intestinale (cu marginile regulate).

În formele cronice focarele necrotice şi chisturile se calcifică, alteori se fibrozează. La nivelul seroaselor se observă lichide extravazate şi inflamaţii: peritonită, pericardită, pleurită exsudativă, fibrinoasă. Uneori se constată dermatită ulcerativă şi limfadenită zonală. Unele predominante lezionale la bovine sunt reprezentate de limfadenopatii hipertrofice, poliserozite, gastro-enterită ulceroasă, encefalită necrotică.

În toxoplasmoza congenitală, leziunile au caracter acut, întâlnit la fetuşi şi nou-născuţi. La femelele gestante se produc leziuni hemoragico-necrotice placentare şi astfel tachizoiţii pătrund şi se dezvoltă în fetus. La rumegătoare cotiledoanele inflamate sunt hipertrofiate, iar focarele necrotice miliare sunt de nuanţă gri. La avortoni se observă encefalită focală necrotică. Focarele albicioase sunt diseminate în substanţa albă din emisferele cerebrale, în pedunculii cerebrali, corpul calos şi cerebel. Leziuni de encefalomalacie. În focarele necrotice sunt prezenţi tachizoiţi intracelulari şi chisturi de Toxoplasma.

Leziunile teratogene sunt exprimate prin: hidrocefalie, microcefalie, polidactilie, microftalmie, anoftalmie, dar sunt mai rar semnalate.

Tabloul clinic poate fi prezentat cu manifestările clinice caracteristice, plecând de la calea de contaminare: congenitală şi câştigată.

La bovine, infecţiile congenitale determină rareori avort, mortalitate la nou-născuţi sau în primele 6 zile de viaţă. Nici infecţiile experimentale cu T. gondii nu au provocat avorturi. Multe cazuri au fost incorect diagnosticate cu toxoplasmoză prin teste imunohistochimice, ele fiind fie avorturi determinate de infecţia cu N. caninum, fie cu Sarcocystis spp (Dubey, 1990). La nou-născuţi, infectaţi transplacentar, boala evoluează acut sau cronic. în primul caz, viţeii prezintă în primele 2 săptămâni de viaţă: febră, 41°C, diaree, inapetenţă, tremurături, decubit lateral cu pedalări ale membrelor sau alte simptome nervoase, respiratorii (dispnee, tahipnee, suflu tubar) şi oculare (retinită, corioretinită, microftalmie). Cronic se produc leziuni cutanate, ulcere, alopecie; sindrom respirator, slăbire, care durează câteva luni, cu prognostic defavorabil (Lafond, 1988).

Diagnostic

Diagnosticul clinic, orientativ, mizează pe semnalarea avorturilor în toată perioada gestaţiei, la primipare, mortinatalitate, fătări de fetuşi mumifiaţi, nou-născuţi debili, rareori cu malformaţii congenitale.

Diagnosticul necropsic evidenţiază prezenţa parazitului şi tabloul lezional predominant la nivelul S.N.C., pulmonului, tubului intestinal, miocardului, musculaturii, limfonodurilor.

Examene microscopice pentru identificarea toxoplasmelor se pot efectua şi pe frotiuri din lichide (L.C.R.. sânge, lapte), din materiale din biopsie limfonodulară, de splină, ficat, măduvă osoasă, colorate M.G.G. sau Giemsa.

Diagnosticul serologic:metode indirecte, cu evidenţierea anticorpilor specifici.

Diagnostic diferenţial. La bovine, avorturile şi mortinatalitatea se vor diferenţia de trichomonoză, neosporoză, sarcocistoză, bruceloză, vibrioză, salmoneloză, leptospiroză, alte avorturi infecto-contagioase, micotice şi toxice.

Neosporoza

Definiţie. Neosporoza, sporozooză incomplet cunoscută, evoluează la câine şi rumegătoare, manifestată prin tulburări nervoase, musculare şi avorturi la taurine, determinată de Neospora caninum. Este semnalată de dată recentă (1984) la câine în Norvegia şi Suedia, apoi în U.S.A. (Bjerkas şi col., 1984; Hilali şi col., 1986; Dubey şi col., 1988). Identificarea, stabilirea sistematicii, denumirea parazitului şi precizarea patoge-nităţii pentru bovine şi ovine sunt realizate de autorii americani (Dubey şi col., 1988; 1989; 1990).

Etiologie. Neospora caninum este sporozoar din clasa Sporozoasida, ord. Eucoccidiorida, subfam. Toxoplasmidae.

Morfologic, se cunosc deocamdată numai stadiile evolutive de trofozoit şi de chist cu bradizoiţi, care sunt foarte asemănătoare cu cele de Toxoplasma.

Se întâlnesc în diverse ţesuturi şi organe, predominant în encefal, musculatura striată, miocard, ficat, pulmon, piele. Parazitează frecvent mononuclearele, celulele endoteliale, neuroni, celulele diverse ale fetuşilor.

Chistul - localizat mai frecvent în S.N.C. (sistemul nervos central), musculatură şi miocard - are dimensiunile variabile: în măduva spinării, de 18-30/12-25µm şi în cerebel de 55-65/25-45 μm, în medie de 19,2 μm. Peretele exterior are grosimea de 1-4 μm, este astructurat cu aspect eozinofilic. În interiorul chistului se află aproximativ 50-200 de bradizoiţi, a căror formă este ovală şi măsoară 3-4,3/1-1,5 μm. Membrana nu are prelungiri spre interiorul chistului, care nu este septat. Prezintă însă multe granule P.A.S. pozitive. Uneori chisturile se prezintă cu membrana subţire sau ruptă, alteori degenerate cu bradizoiţii distruşi. Bradizoiţii în curs de diviziune sunt mai mari, cu aspect globular (Dubey şi col., 1988; Speer şi Dubey, 1989).

Structural, sunt evidente asemănările la Neospora cu formele trofozoide şi chisturile de Toxoplasma şi Hammondia spp., însă testele serologice relevă că reacţiile sunt specifice şi nu denotă afinităţi imunologice.

Tachizoiţii de Neospora au reuşit să fie cultivaţi pe culturi celulare de bovine. De asemenea, s-a reuşit izolarea şi transmiterea experimentală a parazitului de la câine la şoareci (cu evoluţie mortală) şi la pisică.

Ciclul evolutiv este incomplet cunoscut, nereuşind reproducerea experimentală. Nu se ştie, în prezent, dacă ontogenia este asemănătoare cu a Toxoplasmei. Contaminarea se face transplacentar în perioada gestaţiei, probabil şi pe cale genitală, în timpul împerecherii, cu material seminal.

Răspândire geografică. Boala este semnalată la câine sau/şi la bovine în mai multe ţări europene: Ţările Scandinave, Franţa, Olanda, Belgia, Anglia, Ungaria; în U.S.A., Canada, Australia, Japonia şi Noua Zeelandă (Bjerkas şi col., 1984; Hilali şi col., 1986; Dubey şi col., 1988; Anderson şi col., 1991; Uggla şi col., 1989; Dubey şi Sreter, 1992; Okuda şi col., 1992). Probabilitatea de a exista şi în alte ţări este mare, însă confuziile cu toxoplasmoza sunt inerente.

Epizootologie. Sursele de contaminare - incomplet cunoscute - sunt reprezentate de câinii bolnavi şi coioţi, de avortoni, lichidele şi învelitorile fetale de bovine şi ovine. Incidenţa bolii în unele ferme de vaci, de circa 19% din totalul avorturilor, denotă riscuri importante de contaminare. Din avortoni cu leziuni nervoase, 20%; din placente 34% şi cu miocardite 10% (Anderson şi col., 1991; Wonda şi col., 1992; Thornton şi col., 1991). Lipsesc datele privind supravieţuirea tachizoiţilor şi chisturilor în ţesuturi şi în corpul avortonilor. Rezultatele serologice la populaţiile de câini în Anglia relevă că incidenţa cazurilor seropozitive - la titrul de 1:200 - este de 12,9%, fără a prezenta simptome (Trees şi col., 1993).

Receptivitate. Din grupajul primelor observaţii şi cercetări, pare a fi mai mare la câini, care contractează boala la orice vârstă, dar mai ales la tineret, 60%, iar la adulţi 40%. Rasele mai sensibile sunt: Collie, Basset, Dog, Poodle, iar câinii de rasă comună sunt mai rezistenţi; căţelele sunt mai frecvent afectate decât câinii. În ordinea sensibilităţii sunt bovinele, ovinele, mai ales femelele în perioada de gestaţie. Nu se cunoaşte deocamdată dacă neosporoza are sau nu importanţă zoonotică (Dubey şi col., 1989; 1990; Poncelet şi col., 1990). În condiţii experimentale s-au dovedit cu receptivitate: pisica, şoarecele, vaca, oaia şi calul (Dubey, 1990).

Patogeneză. Mecanismele patogene - cele cunoscute - sunt similare celor din toxoplasmoza congenitală. Efectele se datoresc pătrunderii şi dezvoltării tachizoiţilor şi chisturilor în diverse celule şi ţesuturi, predominant în S.N.C., miocard şi musculatură, rareori în ficat, pulmon, pancreas, mucoasa gastrică şi piele.

În celulele şi ţesuturile parazitate se produc procese de necrobioză, cu carioliză, vacuolizare şi consecutiv distrugerii lor parazitul, mai ales bradizoiţii, foarte numeroşi, se diseminează în alte celule, iar la avortoni în tot organismul. Acţiunile inflamatoare şi toxică sunt mai grave la nivelul encefalului, măduvei spinării, placentei şi musculaturii scheletice. Chisturile determină focare de necroză, granuloame, iar cele vechi se pot calcifica. Toxinele metabolice intervin asupra capilarelor sanguine, cu extravazări. Procesele inflamatorii şi necrobiotice ale placentei favorizează migrarea trofozoiţilor spre ţesuturile embrionului sau fetusului.

Imunitate. Procesele imune sunt puţin cunoscute. S-au preparat suşe antigene din tachizoiţi cu reactivitate specifică în testele histo- şi imunoenzimatice. Nu sunt însă cunoscute clasele de anticorpi şi tipurile de imunitate induse. La nou-născuţi s-a identificat IgG (Ogino şi col., 1992).

Modificări morfopatologice. Aspectele lezionale - câte se cunosc până în prezent - se referă la tabloul polimorf din neosporoza câinelui şi cel al fetusului (avortonilor) de taurine. La câine, obişnuit se constată meningo-encefalită multifocală (în emisferele cerebrale, cerebel şi zona piramidală) nesupurată, cu necroze. Uneori se produc: meningo-mielită, cu aceleaşi caractere lezionale necrotice; miocardită şi miozite focale nesupurate (Uggla şi col., 1989; Munday şi col., 1990). Masele musculare mai frecvent afectate sunt: diafragma, maseterii, limba, musculatura membrelor. Rareori se observă: hepatită necrotică insulară sau difuză, pancreatită nodulară, cu noduli necrotici, cu fibrozări marginale, în mărime de până la 4 mm; congestie pulmonară ş i dermatită piogranulomatoasă .

Histologic, în cazul encefalitei se produce infiltraţie perivasculară cu mononucleare şi glioză multifocală; capilarioză însoţită de prezenţa chisturilor şi trofozoiţilor vii sau în diverse stadii de degenerare. Miozitele granulomatoase prezintă infiltraţie cu eozinofile, neutrofile şi limfocite. Miofibrilele sunt distruse şi se observă neosporele. Infiltraţia în miocardită şi hepatită este determinată de mononucleare, se produce hiperplazia celulelor reticulo-endoteliale. Focarele necrotice inflamatorii conţin şi formele de dezvoltare - tachizoiţii şi chisturile - ale parazitului.

La rumegătoare – în special la taurine - tabloul lezional este cunoscut la avortoni şi la nou-născuţi. La avortoni: meningo-encefalită focală, necrotică, nesupurată, însoţită de procese inflamatorii şi necrotice şi în alte organe; rareori miocardită şi miozită însoţite de procese inflamatorii în alte organe; placentită necrotică în focare. La circa 82% din avortoni focarele sunt însoţite de prezenţa tachizoiţilor şi/sau a chisturilor de Neospora (Thilster şi Dubey, 1989; Dubey şi Lindsay, 1990; Otter şi col., 1993). Wouda şi col. (1992) găsesc leziuni inflamatorii şi în ficat, rinichi şi pulmon. La nou-născuţi tabloul lezional este similar cu al avortonilor.

Tabloul clinic. Se cunoaşte simptomatologia la câini şi la bovine.

La bovine, manifestarea caracteristică este avortul, care se produce în toată perioada de gestaţie, însă mai frecvent în lunile 3-4 (circa 80%) şi mai rar în luna a 7-a (13%). Starea generală a vacilor nu este influenţată, mai ales în cazul avorturilor din prima perioadă a gestaţiei. Incidenţa morbidităţii este mai crescută în aprilie-mai şi scăzută în noiembrie-decembrie. Uneori se constată mortinatalitate, viţeii prezentând malformaţii - artrogripoza multiplă, asimetrie toracică. Alteori viţeii sunt născuţi subponderali (de circa 19,5-20 kg). în primele zile de viaţă (3-28) se evidenţiază malformaţiile: scolioză, lordoză, ortogripoza membrelor, anomalii ale măduvei spinării, amioplazie, retracţii musculare. La unii viţei se observă hiporeflectivitate neuromotorie, pedalări ale membrelor, ataxie. Evoluţia cazuiilor este aproape în totalitate letală (Barr şi col., 1991; Dubey, 1989; Dubey şi col., Dubey, 1993; Brian şi col., 1994).

Diagnosticul. Diagnosticul diferenţial la bovine se impune faţă de: toxoplasmoză (cu care a fost confundată această boală ani de-a rândul), sarcocistioză, besnoitioză - formele abortigene; trichomonoză, avorturi bacteriene, virotice şi micotice. La viţei trebuie să se stabililească natura malformaţiilor congenitale - toxică, genetică, infecţioasă - şi a se diferenţia sindromul nervos neosporian de cele cu altă etiologie, infecto-contagioasă sau medicală. Pentru pozitivarea diagnosticului se va recurge la metode paraclinice specifice: teste serologice, însămânţări pe medii speciale de cultură; dozarea unor parametri sanguini şi biochimici.

Diagnosticul pozitiv se bazează pe examenele histologic - metodele de colorare H.E. şi P.A.S. - şi microscopic, din frotiuri şi amprente de organe, colorate M.G.G. în ambele situaţii, se evidenţiază tachizoiţii şi chisturile.

Diagnosticul electronomicroscopic permite unele precizări datorită diferenţierilor electronooptice ale organitelor diferitelor specii de sporozoare (Dubey, 1989; Speer şi Dubey, 1989).

Cu certitudine se utilizează testele serologice. S-a reuşit prepararea de antigene de N. caninum cu o specificitate numai faţă de anticorpii proprii, fără a da reacţii încrucişate cu antigenele altor sporozoare (Toxoplasma, Hammondia, Sarcocystis ş.a.). Testul imunohistochimic al imunoperoxidazei permite precizarea diagnosticului chiar şi în situaţii retroactive. Prin metoda imunoperoxidazei şi cu ajutorul antiserurilor specifice a mai multor sporozoare s-a stabilit că nu se produc reacţii încrucişate, metoda putând fi folosită de rutină în laboratoarele de diagnostic (Lindsay şi Dubey, 1989).

Testul de imunofluorescenţă indirectă (I.F.I.) s-a verificat folosind antigene tachizoiţi de N. caninum cultivaţi pe celule de bovine linia B.P.A.l şi seruri provenite de la vaci infectate cu Neospora sau de la cele avortate. S-au obţinut reacţii pozitive la titrul de 1:320 până la 1:5120, care scad la 21 zile după avort la 1:160 - 1:640. Metoda necesită încă experimentări privind dinamica în timp a titrului anticorpilor. Cercetări s-au făcut şi la alte specii de animale: ovine, caprine (Cole şi col., 1993; Conrad şi col., 1993). Probabil că investigaţiile privind valoarea testului P.C.R. vor oferio altă metodă sensibilă şi specifică în identificarea Neosporei (Kaufmann şi col., 1994).

Prognosticul medical este grav, cu evoluţie letală la fetuşi şi viţei, la câini de orice vârstă. Aspectul economic în ţările în care s-au întreprins anchete în acest sens este important, deoarece avorturile de natură neosporiană ating în unele regiuni 19% din totalul cazurilor. Anderson şi col. (1991) constată că procentajul avorturilor la vaci a avut următoarea structură: Neospora 19%, bacteriene 16,2%, virale 48%, circa 24% neidentificabile şi restul cu altă etiologie. Aspectul economic nefavorabil se datoreşte inexistenţei unui tratament eficace şi necunoaşterii biologiei parazitului.

Tratament. Până în prezent medicina veterinară nu dispune de o medicaţie cu eficacitate. La câini s-au experimentat diferite produse pe bază de: antibiotice, trimetoprim, sulfadiazină, corticoterapie, vitaminoterapie, dar rezultatele nu sunt satisfăcătoare.

La femele, complicaţiile consecutive avorturilor se vor redresa prin terapie simptomatică, similar cu cele din toxoplasmoză.

Profilaxie. Măsurile profilactice fundamentale nu vor putea fi elaborate atâta timp cât nu se va cunoaşte complet biologia parazitului. Acţiunile de profilaxie în fermele de bovine şi de ovine sunt similare celor din cazul toxoplasmozei, exceptând metodele ce vizează intervenţia felidelor: Igienizarea condiţiilor din adăposturi, conservarea furajelor în condiţii corespunzătoare sanitar, neutralizarea (inactivarea) avortonilor, învelitorilor fetale şi subproduselor provenite din sacrificarea animalelor; popularea fermelor cu animale sănătoase. Posibilitatea introducerii testelor serologice în diagnosticul de rutină al neosporozei va influenţa pozitiv supravegherea acestei boli.

În ceea ce priveşte supravegherea câinilor, mai ales a caniselor, se impune efectuarea diagnosticului histologic sau imunoenzimatic în cazul evoluţiei unor boli cu sindroame nervos sau muscular. Măsurile generale igienico-sanitare aplicate riguros vor avea efecte pozitive: dezinfecţii şi dezinsectizări periodice ale cuştilor şi padocurilor; păstrarea condiţiilor de igienă în adăposturi; alimentaţie corespunzătoare calitativ şi cantitativ.

4.2.1.4. Impactului economic al avorturilor de natură neosporidiană la bovine

Pierderile economice pe care le determină neosporoza sunt mai importante în ceea ce priveşte efectivele de bovine şi pot fi incluse în două categorii: a) pierderi directe şi sunt determinate de pierderea viţeilor prin apariţia avorturilor la vacile infectate. Acestea pot să apară la câteva zile după montă sau chiar şi la 7-8 luni de gestaţie. Cu toate acestea cel mai frecvent avorturile apar la 5-6 luni de gestaţie. Au fost semnalate şi cazuri când viţeii care au fost obţinuţi de la vaci infectate au fost născuţi morţi, au murit imediat după fătare, au prezentat semne clinice nervoase sau nu au manifestat nici un semn de boală dar care pot rămâne serologiv pozitivi.Semnele clinice au fost observate numai la bovine cu vârsta mai mică de două luni. Viţeii infectaţi cu N. caninum pot prezenta semne neurologice, pot fi slăbiţi sau incapabili să se ridice. b) pierderi indirecte sunt datorate costurilor care includ asistenţa medical-veterinară şi cele legate de stabilirea diagnosticului, reînsămânţările, posibila pierdere a lactaţiei şi costurile de înlocuire ale eventualelor vaci infectate care trebuie sacrificate.

N. caninum poate influenta semnificativ producţia de lapte. Într-un studiu efectuat de Thurmond şi Hietala în 1997, vacile dintr-un efectiv de 2000 de capetede bovine din California diagnosticate ca fiind seropozitive au produs cu aproximativ un kg de lapte mai puţin decât au produs cele seropozitive. Într-un alt studiu, expunerea la infecţia cu N. Caninum a determinat într-un efectiv de 700 de vaci din Florida scăderi a producţiei de lapte cu aproximativ 3-4% determinând o pierdere de 128$ pe vacă pe lactaţie (Hernandez şi col., 2001). Romero şi col. (2005) au menţionat că vacile seropozitive au produs cu 84,7 litri de lapte mai puţin în 305 zile de lactaţie în Costa Rica. Într-un studiu canadian pe vaci de lapte din provincia Maritime producţia de lapte nu a fost asociată cu seropozitivitatea, vacile seropozitive producând aceeaşi cantitate de lapte ca şi cele seronegative (Hobson şi col., 2002). Metodele folosite pentru a calcula cantitatea de lapte produsă au fost identice cu cele folosite în studiul din California. Cu toate acestea, acest subiect rămâne de discutat din cauza faptului că în Noua Zeelandă vacile seropozitive au produs mai mult lapte decât cele seronegative (Pfeifer şi col., 2000). Bartels şi col. (Bartels şi col., 2006) au raportat modificări în ceea ce priveşte producţia de lapte în fermele în care au existat episoade epidemice de avorturi. Efectul a fost prezent numai la animalele seropozitive în primele 100 de zile de lactaţie şi numai în primul an după episoadele abortive.

Nu există date concrete în ceea ce priveşte pierderile determinate de neosporoză în fermele de bovine (Antony şi Williamson, 2001; Trees şi col., 1999). S-a estimat că în California aproximativ 40.000 de avorturi datrate neosporozei au determinat pierderi aproximative de 35 de milioane de dolari pe an (Barr şi col., 1998). In Australia şi Noua Zeelandă pierderile sunt apreciate la peste 100 milioane de dolari australieni pe an (Pitel şi col., 2003). În Elveţia, pirerile sun de aproimativ 9,7 milioane euro/an. În Canada pierderile într-o fermă de 50 de vaci pierderile au fost de 2.304$ (Chi şi col., 2002). În Olanda, 76% din efectivele seropozitive care nu au avut episoade abortive nu au avut pierderi, în timp ce în restul de 24% pierderile au crescut notabil de până la 2000 de euro pe an (Bartel şi col., 2006). Şi mai mult, în fermele cu avorturi epidemice costurile pe cap de animal au fost de 50$ pe doi ani după episodul abortiv şi au exclus piederile din timpul avorturilor, dar includ pierderile legate de eliminarea prematură din efectiv, vârsta la care a avut loc prima fătare, pierderea produţiei de lapte, tratamentul şi diagnosticul (Bartel şi col., 2006). În efectivele de vaci de carne din SUA un studiu simulator pe 5 ani care a studiat diferitele strategii de control ale acestei boli a arătat că revenirea economică se poate realiza prin testarea întregului efectiv şi eliminarea descendenţilor vacilo seropozitive şi înlocuirea lor (Larson şi col., 2004). În fermele din Noua Zeelandă şi Australia s-a arătat că opţiunea economică cea mai bună este cea de „neitervenţie” dacă în efectiv prevalenţa este până la 18-21%. În cazul în care prevalenţa este mai mare, măsura cea mai bună este vaccinarea (Reichel şi Ellis, 2006). Într-un studiu elveţian cea mai bună strategie de control este întreruperea reproducerii vacilor seropozitive (Hasler şi col., 2006a, b).

4.2.2. Studiu bibliografic privind neosporoza la câine şi alte specii de animale – P1

4.2.2.1. Neospora caninum - Parazitul

Neospora caninum este un parazit protozoar din familia Sarcocystidae, increngatura Apicomplexa si care prezinta o mare similaritate cu Toxoplasma gondii.

Parazitul a fost pentru prima data detectat in 1984 la caini cu “schiopatat” si, timp de cativa ani, a fost asociat numai cu boli ale cainilor.

In jurul anului 1990 s-a lamurit asocierea acestui parazit cu avorturile la bovine, fiind cunoscut acum ca cea mai des intalnita cauza a acestora. Neospora caninum este asemanatoare cu Toxoplasma gondii, dar cei doi paraziti sunt diferiti din punct de vedere al antigenitatii si ultrastructurii.

4.2.2.2. Descrierea agentului - Structura

Studiile morfologice prin electronomicroscopie ale parazitului au aratat ca Neospora caninum are o structura tipica subcelulara, fiind clasificat ca facand parte din familia Sarcocystidae, subclasa Coccidiasina a increngaturii Apicomplexa (Ellis şi col., 1994).

Acest parazit este structural foarte asemanator cu Toxoplasma gondii si specii din genul Hammondia.

Stadiile infectioase cunoscute ale N. caninum sunt tachizoitii, chisturile tisulare si oochistii.

Tachizoitii sunt ovoidali, alungiti sau rotunzi, de aproximativ 2-3 x 5-7 μm. Neospora caninum, in functie de stadiul de diviziune, este localizata in creierul, miocardul, plamanii si placenta gazdei, dar in primul rand in sistemul nervos central.

In gazda, tachizoitii sunt localizati in citoplasma celulara cu sau fara vacuole parazitofore si prezinta organele tipice celor gasite in tachizoitii de Toxoplasma gondii. Tachizoitii au o membrana plasmatica trilamelara, 22 microtubulete subpeliculare, doua inele apicale, un inel polar, un conoid, 1-3 mitocondrii, pana la 150 microneme, 8-12 roptrii situate anterior nucleului si 4-6 roptrii situate posterior nucleului, complex Golgi, reticul endoplasmatic rugos si neted, un nucleu si un nucleol.

Chisturile tisulare sunt de obicei rotunde-ovale, de pana la 107 μm lungime si au fost gasite in diverse specii, afectand in principal tesuturile nervoase, cum ar fi creierul si maduva spinarii. Peretii chisturilor sunt netezi si de pana la 4 μm, depinzand de cat de veche este infectia. La cele mai multe chisturi, peretele chistic este de 1-2 μm grosime. Chisturile tisulare contin structuri tubulare ramificate. Nu exista perete chistic secundar si nici sept.

Chisturile contin stadii ale parazitului denumite bradizoiti care sunt structuri subtiri (6-8 x 1-1.8 μm) si contin aceleasi organelle ca cele din tachizoiti, cu exceptia faptului ca exista doar cateva roptrii si mai multe granule pozitive in bradizoiti. In plus, structuri veziculare tubulare ce pot contine micropori sunt prezente intre bradizoiti.

In 1998, prin studii experimentale, McAllister si colaboratorii au detectat stadiul sexual al acestui parazit coccodian, oochistul. Oochisti nesporulati si neinfectiosi de 10 - 12 μm diametru au fost observati in materii fecale proaspete. Oochistii devin sporulati si infectiosi in 3 zile in afara gazdei. Oochistii sporulati au 2 sporochisti, fiecare continand 4 sporozoiti. Exista descrieri ale unei noi specii de Neospora (N. hughesi n. sp.), izolata din sistemul nervos central al unei ecvine adulte in California.

Caracteristicile structurale ale acesteia sunt foarte asemanatoare cu Neospora caninum, dar N. hughesi izolate au prezentat diferente fenotipice la proteinele imunoreactive.

4.2.2.3. Ciclul de viaţă

Neospora caninum prezinta un ciclu de viata in doua gazde, cu cainele ca gazda definitiva (Fig. 4.2.2.1.).

Gazda definitiva, gazda in care are loc reproducerea sexuala a parazitului, nu a fost cunoscuta multi ani. A fost suspectat un carnivor, dar numai in 1998, cercetatorii au gasit oochisti in materiile fecale ale cainilor hraniti cu soricei infectati cu Neospora caninum.

Oochistii sunt sub-sferici, de 10-11 µm in diametru si nesporulati la eliminare. Oochistii sporuleaza in 3 zile si contin 2 sporochisti, fiecare cu cate 4 sporozoiti. Nu se cunoaste inca perioada pana cand un caine infectat incepe sa imprastie oochisti si cat de des. De asemenea, nu sunt cunoscute conditiile de supravietuire ale oochistilor in mediu.

Diferite specii de mamifere pot fi gazde intermediare pentru Neospora caninum, de exemplu bovinele, oile, caprele, caprioarele, caii si probabil, datorita dovezilor serologice, bivolii, coiotii, vulpile si camilele. Ca infectie naturala, acest parazit a fost cel mai des intalnit la bovine si caini.

Tachizoitii de Neospora caninum, penetreaza celulele gazda prin invazie activa. Tachizoitii sunt de 3-7x1-5 µm dimensiune si se divid prin fisiune binara.

Tachizoitii sunt situati intr-o vacuola parazitofora in interiorul citoplasmei celulei gazda. Tachizoitii cei mai rapid dezvoltati sunt eliminati prin intermediul raspunsului imun al gazdei care conduce dezvoltarea acestora catre stadiul de bradizoiti inchistati cu dezvoltare lenta.

Stadiile intestinale in gazda definitiva reprezinta o conditie obligatorie pentru reproducerea sexuala a parazitului. Neospora caninum poate, totusi, sa se transmita si de la mama la fetus in timpul gestatiei.

S-au identificat trei stadii infectioase ale parazitului Neospora caninum: tachizoitii, bradizoitii si oochistii. Tachizoitii si bradizoitii sunt stadii asexuale ale parazitului si au localizare intracelulara.

Oochisturile de Neospora caninum sunt similari morphologic cu Hammondia heydorni gasita in materii fecale de caine si cu Toxoplasma gondii si Hammondia hammondi gasite in materii fecale de pisica.

Neospora caninum are un ciclu de viata in doua gazde. Cainii si coiotii sunt gazde definitive, de asemenea lupii ar putea fi gazde definitive, desi nu exista date care sa demonstreze excretia de oochisti de N. caninum. Cainii se infecteaza si imprestie prin fecale oochisti dupa ingerarea de tesuturi infectate ale gazdelor intermediare. Recent, s-a demonstrate ca un catel poate produce si imprastia mai multi oochisti decat un caine adult (Gondim şi col., 2005). Bovinele si alte specii de animale, cum ar fi bivolii, porcii, vulpile, caprioarele, maimutele, pot fi gazde intermediare pentru acest parazit. Gazdele intermediare se infecteaza dupa ingerarea de hrana si apa contaminate cu oochisti sau dupa ingerarea de tesuturi de la animale infectate.

Initial, s-a crezut ca N. caninum are un ciclu de viata la fel ca cel al T. gondii, cu gazda definitiva o carnivora si s-a demonstrat acest lucru. Totusi, calea de transmitere orizontala a acestui parazit nu este foarte clara.

Calea de transmitere verticala s-a stabilit aproape simultan cu descoperirea parazitului. N. caninum se poate transmite transplacentar foarte eficient la caini, pisici, bovine, ovine, caprine, cai si soareci. Transmiterea orizontala nu a fost observata la speciile studiate, desi exista cazuri care sustin aceasta cale de transmitere. Ratele de infectare postnatala sunt variabile si sunt dependente de tara, regiunea din tara, testele de detectie si valorile cut-off ale testelor utilizate in studii. Infectii naturale au fost diagnosticate la caini, bovine, capre, cai, oi, caprioare, bivoli si camile.

Fig. 4.2.2.1.: Ciclul biologic la Neospora caninum

Infectii experimentale au putut fi obtinute prin inoculari subcutanate, intraperitoneale, intramusculare sau orale. De asemenea, studii recente au sugerat ca o posibila cale de transmitere este cea orala via colostru. Aceste experimente au aratat ca doi vitei nou nascuti, infectati cu tachizoiti de N. caninum prin colostru, au prezentat urme de ADN in creier , desi nu au fost observate leziuni patologice, iar parazitul nu a fost detectat prin imunohistochimie si, de asemenea, nu a fost posibila reizolarea N. caninum din celulele creierului. Aceste studii sprijina posibilitatea transmiterii orizontale prin ingerarea de oochisti de pe iarba, din apa sau din hrana contaminate.

S-a testat, de asemenea, posibilitatea transmiterii venerice si nu s-au obtinut date clare privind aceasta. Ortega-Mora si col. (2003) au descoperit ADN in sperma conservata sau congelata, prin real-time PCR. Incarcatura medie in paraziti in sperma neconservata a fost mica (1 - 2.8 paraziti/ml sperma). De asemenea, s-a observat prezenta ADN N. caninum mai frecvent in fractiunea celulara, dar nu s-a gasit ADN specific in lichidul seminal.

Astfel, s-a concluzionat ca tachizoitii de N. caninum sunt asociati cu orice tip de celula. Urmatoarele studii ar trebui, astfel, sa determine daca sperma de la taurii infectati pot infecta vacile sau vitelele inseminate.

Un alt studiu, efectuat de Baillargeon si col. (2001) in care vaci seronegative si seropozitive au primit embrioni de la donatori seropozitivi si seronegativi a demonstrat ca nici unul dintre cei 70 de fetusi sau vitei nascuti din vaci seronegative nu a fost seropozitiv, in timp ce 6 din cei 8 nascuti din vaci seropozitive au fost seropozitivi la N. caninum.

Recent, Neospora caninum a fost identificata in numar mic (1-10 paraziti/ml) in sperma taurilor seropozitivi, infectati natural. Astfel, un studiu a examinat transmiterea prin sperma congelata, contaminata artificial cu 10⁶-10⁷ tachizoiti de N. caninum, pe un numar de 8 vaci (4 au fost utilizate in experiment si 4 au fost utilizate ca martor). Nici una dintre cele 4 vaci inseminate cu sperma contaminata nu a devenit gestanta, iar dintre cele 4 vitele utilizate ca martor, numai una a devenit gestanta.

Un alt studiu a utilizat 18 vaci primipare (9 au fost expuse N. caninum, iar 9 au fost utilizate ca martor). Vacile expuse au fost inseminate cu sperma contaminata cu 10⁷ tachizoiti de N. caninum. Toate cele 9 vaci expuse au suferit seroconversie, iar ADN de N. caninum a fost gasit in sangele tuturor celor 9 vaci expuse si in creierul, plamanii, ficatul si cornul uterin al multora dintre ele. La necropsia efectuata la 36 de zile dupa inseminare, una dintre cele 9 vaci expuse parazitului a avut embrioni viabili si 6 dintre cele 9 vaci utilizate ca martor au avut embrioni viabili. In timp ce aceste date sugereaza ca Neospora caninum poate sa se transmita prin sperma si joaca un rol deosebit de important in moartea embrionara timpurie, ar trebui luate in seama si alte explicatii. Amandoua studiile utilizeaza doze de inoculare cu 4-5 ordine de marime mai mari decat cele recunoscute in mod curent in infectiile naturale. Semnificatia acestor rezultate nu este sigura in epidemiologia infectiei cu Neospora caninum, dar aceste rezultate pot fi punctual de plecare al unor cercetari viitoare.

4.2.2.4. Leziuni anatomopatologice

Multiplicarea rapida intracelulara a tachizoitilor de Neospora caninum cauzeaza moartea celulara, lucru care determina leziuni necrotice vizibile in cateva zile.

Tachizoitii sunt in principal prezenti in creier si tesuturi nervoase unde pot distruge un numar mare de celule, inclusive cele ale nervilor cranieni si spinali. Un focar de celule mononucleare infiltrate in jurul ariei de necroza este leziunea caracteristica in sistemul nervos central in neosporoza. Tachizoitii afecteaza, de asemenea, conductivitatea celulelor infectate si pot determina afectiuni severe neuromusculare la caini, bovine si probabil si alte gazde.

Chisturile tisulare de Neospora caninum nu sunt, de obicei, asociate cu leziuni. Nu se stie cat timp aceste chisturi persista in sistemul nervos central, dar se stie ca acestea raman viabile, la soriceii infectati experimental, pentru cel putin 1 an (Lindsay şi col., 1992).

La cazurile canine, s-au descris leziuni, in principal in sispemul nervos central si secundar in muschi si alte tesuturi. Fetusii bovini avortati sunt, de obicei, autolizati sau mumificati si, din aceasta cauza, foarte dificil de examinat. Leziuni evidente sunt rare, dar pot fi gasite ca focare de necroza pale in muschii scheletali si in inima sau ca focare de necroza, de la pale la inchise, in creier.

Intr-un studiu al neosporozei fetale bovine, s-au observat leziuni histologice in creier, inima si ficat in 91% din cele 80 de cazuri studiate. De asemenea, s-au gasit leziuni inflamatorii si degenerative in muschi scheletali si alte tesuturi fetale.

4.2.2.5. Imunitate

Infectiile experimentale cu Neospora caninum nu prezinta simptome la vaccine negestante sau la anumite linii de soricei, sugerand ca sistemul imun al acestor animale este capabil sa controleze infectia. S-a observat ca Neospora caninum determina obtinerea unui raspuns imun mediat si umoral si celular in animalele infectate.

Infectia experimentala cu Neospora caninum la bovine a aratat un raspuns imun in anticorpi de tip IgG in 3 saptamani. Prezenta anticorpilor probabil nu asigura controlul infectiei care in cele mai multe cazuri depinde de mecanisme immune mediate celular.

Chiar daca detaliile raspunsului mediat celular nu sunt inca pe deplin elucidate, o rezistenta cu rol protector la N. caninum depinde de IL-12 si interferon, in timp ce tratamentul cu aceleasi citochine determina tulpinile sensibile sa devina mai rezistente.

4.2.2.6. Cultivare

Neospora caninum a fost cultivata “in vitro” pe mai multe tipuri de celule. Atunci cand a fost izolat parazitul pentru prima data de la un caine bolnav in 1987, au fost utilizate monocite bovine si celule endoteliale arteriale cardiopulmonare.

S-a reusit cultivarea acestui parazit pe cateva linii celulare stabilizate, printer care celulele Vero. In culturile celulare, Neospora caninum se prezinta sub forma de tachizoiti, dar studii recente au aratat ca in conditii de cultivare extreme se poate determina dezvoltarea de forme apartinand bradizoitilor.

Organismele parazitare obtinute prin cultivare sunt infectioase pentru animale si tachizoitii pot fi pasati continuu timp de 8 ani, fara a se inregistra vreo pierdere a infectiozitatii pe soricei. De asemenea, prin crioconservare, tachizoitilor obtinuti pe culture celulare li se pastreaza infectiozitatea.

4.2.2.7. Neospora caninum la caini

Cele mai multe cazuri de neosporoza la caini s-au intalnit la cateii infectati congenital, in special in primele sase luni de viata. Acestia dezvolta pareze progresive si pareze severe la membrele posterioare si ataxie care devin progresiv din ce in ce mai severe, cauzate de polimiozite, poliradiculite si meningoencefalite diseminate.

De asemenea, s-au raportat si cazuri de neosporoza cutanata manifestat prin dermatite ulcerative piogranulomatoase. Cainii adulti, de asemenea, pot suferi de neosporoza si semne clinice ale acestei boli au fost observate la caini in varsta de 15 ani.

Tratamentul timpuriu antiprotozoar poate determina recuperarea in aproximativ 50% dintre cazuri. De asemenea, catelele pot transmite parazitul in timpul gestatiei cateilor din gestatii diferite.

4.2.2.8. Infectiile cu Neospora caninum la bovine

Gestaţia la bovine şi avorturile

Media timpului de gestatie la bovine este de 280-285 zile, in functie de tipul rasa. Avortul este definit ca expulzia fetusului intre a 42-a zi dupa conceptie si aproximativ a 260-a zi de gestatie. Inainte de a 42-a zi de gestatie, moartea embrionului, in general, determina resorbtia sau expulzarea produsului de conceptie fara a se observa semen clinice la vaca. Expulzarea fatului dupa a 260-a zi este privita ca o parturitie timpurie.

Cauza unui avort este, deseori, dificil de determinat. Cele mai multe avorturi sunt considerate a fi datorate unor cause neinfectioase, cum ar fi dereglarile genetice, teratogenii, dereglarile nutritionale, plantele toxice, desincronizari hormonale, corticosteroizi, cause fizice si endotoxine.

Agentii infectiosi ca virusurile, bacteriile, fungi, drojdiile si protozoarele pot determina, de asemenea, avorturi.

Un diagnostic specific este obtinut pentru numai 23-46% dintre fetusii trimisi la laboratoarele de diagnostic, in cele mai multe cazuri fiind diagnosticate boli infectioase. Intr-un studio efectuat in SUA, din 9000 fetusi bovini avortati, 33% dintre avorturi au fost diagnosticate: 30% au avut o cauza infectioasa, 2,5% - cauza neinfectioasa; dintre acestea 14% au fost cauzate de bacterii, 11% de virusuri si 5% de infectii fungice.

Prevalenta

Infectia cu Neospora caninum la bovine a fost raportata in diferite tari pe intreg globul. Neosporoza este considerata ca fiind cea mai frecventa cauza a avorturilor la bovine la nivel mondial (Dubey, 2005). Prevalenta N. caninum la bovine difera intre tari si regiuni. Mai mult, seroprevalenta infectiei cu Neospora caninum estimata variaza considerabil: in Europa, intre 16-83% dintre fermele de vaci de lapte au fost confirmate ca avand animale infectate cu Neospora caninum. Totusi, seropozitivitatea bovinelor in fermele infectate variaza considerabil si, in unele ferme, pana la 87% dintre bovine sunt seropozitive.

Simptome

Vacile adulte negestante care sunt infectate cu Neospora caninum nu prezinta nici un semn al bolii, in schimb, vacile gestante pot suferi avorturi. Avorturile pot aparea spontan, indiferent daca infectia este recenta, cronica sau congenitala.

Mai mult, vacile infectate cu Neospora caninum pot avorta in gestatii sucesive. Avorturile asociate parazitului Neospora caninum pot avea loc in toate stadiile gestatiei si pot include si fatari de produsi morti au neviabili, totusi in cele mai multe cazuri se inregistreaza avorturi la mijlocul sau spre sfarsitul gestatiei.

Avorturile pot avea loc pe toata perioada anului si pot fi epidemice, endemice sau sporadice. Avortul epidemic reprezinta un numar mare de vaci gestante din ferma care avorteaza intr-o perioada scurta de timp, in timp ce termenul de avort endemic se refera la situatia in care avorturile se desfasoara pe intreg anul sau pe mai multi ani.

Studiile experimentale au aratat important ape care o are o infectie cu Neospora caninum pe perioada gestatiei. Astfel, la bovine, infectiile din timpul gestatiei timpurii par sa cauzeze moarte fetala si resorbtie a produsului de conceptie, mai mult decat avorturi. Infectarea in perioada medie a gestatiei poate determina avorturi sau nasteri de vitei infectati persistent.

Totusi, in infectia din perioada tarzie a gestatiei, vacile fata normal si cei mai multi vitei sunt clinic sanatosi, dar pot fi infectati congenital. Vacile seropozitive nu avorteaza obligatoriu, insa poate creste riscul de avort de 3-19 ori fata de cele seronegative.

Intr-un studiu s-a descoperit ca vacile primipare seropozitive prezinta cel mai mare risc de avorturi, iar acest risc descreste la gestatiile urmatoare. Avorturi repetate pot aparea la aceeasi vaca, dar frecventa lor nu este cunoscuta.

Nu a fost clarificata modalitatea prin care infectia cu Neospora caninum poate determina probleme de reproducere in stadii timpurii ale gestatiei. Unele studii au demonstrate ca vacile sau vitelele seropozitive necesita mai multe inseminari pana la confirmarea gestatiei, in comparative cu cele seronegative. Acest lucru poate indica faptul ca a avut loc o pierdere fetala timpurie.

Viteii infectati cu Neospora caninum se nasc, de obicei, sanatosi, neprezentand nici un semn al bolii. In schimb, intr-un studiu, viteii infectati au prezentat o mortalitate mai mica in perioada preintarcarii decat viteii neinfectati. Unii dintre viteii infectati congenital se nasc vii, dar sunt bolnavi sau devin bolnavi in primele 2 luni de viata. Parazitul afecteaza sistemul nervos central, rezultand semne neurologice, cateodata exoftalmie si asimetrie oculara. Membrele posterioare si/sau anterioare pot fi flexate sau hiperextinse. Cateodata, un numar mic de vitei proveniti de la vacile infectate se nasc neinfectati.

Diagnostic

Prezenta anticorpilor fata de Neospora caninum in ser indica faptul ca animalul este sau a fost anterior infectat.

Anticorpii pot fi pusi in evidenta prin testul de imunofluorescenta indirecta, imunoblot, ELISA sau testul de aglutinare directa. Un test ELISA de detectie a IgG de aviditate poate fi utilizat pentru a discrimina intre infectiile recente si cele cronice cu N. caninum la bovine (Bjorkman şi col., 1999).

Pentru a se stabili un diagnostic definitiv al neosporozei, este necesara efectuarea necropsiei fetusului sau vitelului, recoltandu-se probe din creier, inima si ficat pentru examene histopatologice si fluide ale corpului sau ser pentru detectia prezentei anticorpilor.

Intrucat nu exista leziuni histopatologice majore specifice in neosporoza, trebuie identificata prezenta N. caninum in tesuturi pentru a se stabili diagnosticul.

Organismele apartinand Neospora caninum nu pot fi diferentiate de alte specii din increngatura Apicomplexa prin colorari histologice clasice, dar pot fi identificate prin imunohistochimie.

In aceasta metoda, parazitul este pus in evidenta prin utilizarea de anticorpi specifici fata de Neospora caninum.

S-au pus la punct cateva metode PCR de detectie a ADN parazitar in tesuturi proaspete, probe provenite de la fetusi bovini avortati, fixate in formaldehida sau inglobate in parafina. Aceste tehnici au fost, de asemenea, utilizate pentru a detecta infectiile cu N. caninum in diferite tesuturi bovine, cum ar fi creierul, maduva spinarii, inima si placenta, ca si in lichidul amniotic al vacilor infectate.

Mai mult, PCR a fost utilizat pentru detectia oochistilor N. caninum in materii fecale de la caini. Tehnicile sunt PCR inalt sensibile si specifice si mai putin afectate de autoliza decat tehnicile histopatologice.

Prezenta anticorpilor fata de Neospora caninum in fluidele biologice provenite de la fetusi sau vitei nou nascuti indica infectia. Totusi, absenta anticorpilor nu inseamna si lipsa neosporozei. Fetusii pot sa nu fi devenit imunocompetenti la momentul infectiei sau timpul scurs din momentul infectarii si avort poate fi foarte scurt pentru a se fi putut sintetiza anticorpii. Mai mult, autolize severe pot cauza degradarea imunoglobulinelor fetusilor.

Tehnicile serologice pot fi utilizate la viteii nou nascuti pentru a se determina daca sunt sau nu infectati, insa datorita faptului ca anticorpii colostrali pot exista timp de cateva luni, este necesara recoltarea de probe pentru serologie inainte ca viteii sa consume colostru.

La animalele adulte, serul este cel mai utilizat material biologic pentru demonstrarea prezentei anticorpilor fata de Neospora caninum, insa anticorpi specifici au fost gasiti si in secretiile vaginale si saliva. De asemenea, se poate utiliza si laptele pentru detectia de anticorpi.

Testele de detectie a anticorpilor pot fi utilizate si atunci cand se doreste determinarea anticorpilor specifici fata de parazit in laptele provenit de la fermele de vaci de lapte.

Serologia reprezinta, insa, un instrument nepretuit atunci cand se doreste sa se stie daca avortul unei vaci sau daca avorturile dintr-o ferma de vaci sunt cauzate de expunerea animalelor la N. caninum.

S-a demonstrat, de asemenea, ca cele mai multe vaci infectate natural sunt seropozitive in momentul avortului, insa, datorita faptului ca nivelele de anticorpi fluctueaza pe perioada gestatiei, cateodata, vacile infectate pot fi seronegative.

Diagnosticul de certitudine in neosporoza este reprezentat de izolarea parazitilor viabili prin cultivare pe culture celulare si prin inoculare pe soricei (bioproba pe soricei). Totusi, multe izolate viabile nu pot fi cultivate intrucat cele mai multe N. caninum mor odata cu moartea fetusilor (Dubey, 2005).

Epidemiologie

Neosporoza la bovine a fost raportata in tari si regiuni pe intregul glob. In unele regiuni, o proportie mare de avorturi la bovine sunt considerate a fi cauzate de Neospora caninum. In California si Olanda, 20-43% si, respectiv 17% din avorturile la bovine sunt cauzate de acest parazit. In Suedia, prevalenta N. caninum la vacile de lapte este estimata la 2%, iar anticorpi specifici au fost detectati in seruri provenite la 7% din vacile de lapte din ferme de vaci cu avorturi. Neospora caninum afecteaza atat vacile de lapte, cat si pe cele de carne.

Dovezile serologice ale expunerilor la infectiilor cu N. caninum este des intalnita in industria carnii de vita si in fermele de vaci de lapte din SUA. Supravegherea seroprevalentei animalelor individuale in fermele de vaci acopera 18-23% dintre acestea, cu o seroprevalenta individuala cuprinsa intre 0-67%. In testele de supraveghere a fermelor de vaci de lapte s-au testat 16-36% dintre animalele individuale, seroprevalenta a variat intre 0-100%.

S-a demonstrat o asociere negativa intre serostatusul N. caninum si cresterea in greutate corporala post-intarcare, caracteristicile carcaselor si costul tratamentului. Testele viitoare trebuie sa valideze aceste rezultate. Riscurile de avort sunt de aproximativ 2-7 ori mai mari la vacile seropozitive comparative cu cele seronegative. Vacile seropozitive care au prezentat avorturi anterior sunt de aproximativ 5 ori mai susceptibile de a suferi un nou avort, spre deosebire de cele care nu au prezentat istoric de avorturi.

Datele epidemiologice sugereaza ca vacile se pot infecta cu Neospora caninum atat prin transmiterea verticala a acestui parazit, cat si prin transmiterea orizontala, insa cea verticala (transmiterea transplacentara) este cea mai frecvent intalnita cale de transmitere la bovine. Mecanismul acestei transmiteri a parazitului este putin cunoscuta, insa transmiterea verticala repetata poate avea loc in timpul gestatiilor sucesive si vitelele infectate congenital pot sa dea nastere la vitei, de asemenea infectati congenital.

Studiile interpretate prin modele matematice au indicat faptul ca transmiterea verticala singura nu poate sa mentina infectia cu Neospora caninum intr-o ferma de vaci. Transmiterea orizontala, reprezentata de animalele care se infecteaza dupa nastere, este o conditie esentiala pentru a se mentine infectia intr-o ferma. Transmiterea orizontala a fost verificata experimental ca are loc, demonstrand ca bovinele se pot infecta prin consumarea de oochisti proveniti de la caini si coioti. Cainii se infecteaza si imprastie oochisti prin materii fecale la doua saptamani dupa consumarea de tesuturi sau placenta provenite de la vaci infectate cu Neospora caninum.

Studiile experimentale au aratat ca tachizoitii din colostru sau lapte pot infecta, pe cale orala, viteii nou nascuti. Totusi, parazitii nu au fost niciodata detectati in colostrul sau laptele vacilor infectate natural. Acestea pot, probabil, sa fie infectate prin ingerarea de tesuturi care contin tachizoiti sau chisturi tisulare (Fioretti si col., 2000).

Momentul infectarii sau recrudescentei poate fi important in determinarea rezultatelor infectiei cu N. caninum. S-a urmarit momentul infectarii experimentale la vaci dupa administrarea intravenoasa a 10 tachizoiti. Din 6 vaci infectate cu 9 saptamani inainte de fatare, toate 6 au dat nastere, la termen, la vitei seronegativi, desi s-a stability clar ca vacile erau infectate. Infectarea experimentala a 6 vaci la 10 saptamani de gestatie a condos la avorturi, trei saptamani mai tarziu, la 5 dintre cele 6 vaci, in vreme ce infectarea la 30 de saptamani de gestatie determina obtinerea de vitei normali clinic, dar seropozitivi si infectati congenital de la toate cele 6 vaci.

Godim si col. (2005) au inoculat vaci, pe cale orala, cu un numar variabil de oochisti (1500-115000), in diferite momente ale gestatiei, variind din a 70-a pana in a 176-a zi. S-a concluzionat ca numarul crescut de oochisti si expunerea cat mai tarzie in gestatie, creste riscul unei infectii fetale. Numai una dintre cele 19 vaci inoculate au prezentat avort, dar 17 dintre cele 19 vaci au devenit seropozitive.

Viteii nascuti vii au fost eutanasiati si, pe baza evidentelor histologice si imunohistologice, au fost declarati infectati 6 vitei.

Diferentele intre cele doua studii pot fi datorate cailor de expunere diferite. Primul studiu a utilizat o inoculare intravenoasa si aceasta poate determina o recrudescenta mai mare a chisturilor tisulare si o transmitere intravenoasa a parazitului la fetus. Inocularea orala este mai apropiata de expunerea orala la parazit si transmiterea orizontala a infectiei. In ambele cazuri, dozele asemanatoare unei expuneri naturale sunt necunoscute si astfel, este dificil sa se aplice aceste rezultate in productie.

Impactul economic

Neosporoza este recunoscuta ca fiind cauza unor pierderi economice substantiale, atat in industria carnii de vaca, cat si in cea a produselor lactate, dar nu exista date concludente despre acestea.

Avorturile par sa fie principala cauza a pierderilor economice si exista deja estimari ale costurilor directe si indirecte datorate avorturilor cauzate de Neospora caninum.

In America de Nord, in California, s-a estimat o pierdere economica datorata avorturilor provocate de Neospora caninum de circa 35 milioane de dolari/an, iar in provinciile maritime ale Canadei de 1064 dolari/an.

O medie anuala a pierderilor ca o consecinta a cazurilor de avorturi asociate N. caninum in Noua Zeelanda a fost estimata la aproximativ 15,7 milioane de dolari la nivel national si de 4451 dolari la nivel de ferma individuala.

In Europa, pierderile economice directe datorate N. caninum au fost estimate la 11 milioane dolari/an in fermele de vaci de lapte din Elvetia si de 2572 dolari/an in fermele olandeze de vaci de lapte, ferme care s-au confruntat cu episoade de avorturi epidemice associate infectiilor cu N. caninum.

Infectiile cu N. caninum pot, de asemenea, sa afecteaza productia de lapte a vacilor de lapte.

In doua studii realizate in America de Nord, s-a demonstrate ca vacile seropozitive produc cu circa 345-363 kg lapte mai putin lapte in perioda de lactatie de 305 zile, decat vacile seronegative, reprezentand o pierdere de aproximativ 128 dolari/vaca seropozitiva in lactatie.

Totusi, intr-un studiu efectuat de Keefe şi VanLeeuwen (2000), la 90 de ferme de vaci, s-a constatat ca vacile seropozitive au produs putin mai mult lapte decat cele seronegative.

Alte efecte ale neosporozei care pot cauza pierderi economice sunt pierderea de fetusi, nasterea de vitei neviabili sau slabi, inseminarea repetata, etc.

Prevenire si control

O cale majora de infectare cu Neospora caninum a fermelor de vaci este aceea de la mama la fat. O modalitate de a reduce rata de infectie este aceea de a se elimina vacile infectate, avand ca ratiune faptul ca cele mai multe dintre vacile infectate pot da nastere la vaci infectate.

Recent, s-a demonstrat ca strategia de a testa si a indeparta vacile pozitive pentru a controla infectia cu Neospora caninum in fermele de vaci de lapte australiene (Ellis şi col., 2004).

Eliminarea de la monta a vitelelor provenite de la vaci infectate reprezinta o alta strategie de a controla infectia cu Neospora caninum in fermele de lapte prin limitarea ratei inalte de transmitere verticala a infectiei. Aceasta reduce numarul animalelor infectate in ferma prin blocarea infectiei transplacentare.

In plus, achizitionarea si retinerea selectiva a vitelor seronegative pot reduce prevalenta animalelor seropozitive in fermele de vaci. Date experimentale au indicat ca Neospora caninum nu se transmite prin transfer de embrioni de la donatori seropozitivi la vaci seronegative. Astfel, transferal de embrioni poate fi o metoda alternativa de a preveni infectia congenitala daca se utilizeaza ca receptori numai vaci seronegative. De asemenea, este important sa se minimalizeze riscul infectiei prin caini.

Masurile specifice includ indepartarea fetusilor avortati, viteilor morti si placentele provenite de la vacile infectate astfel incat cainii san u le poata manca. Expunerea vacilor la materiile fecale ale gazdei definitive poate fi redusa prin scaderea numarului de caini (sau alte gazde intermediare suspecte, spre exemplu alte canine) in ferma, adapostirea hranii si facilitatilor pentru a se preveni contaminarea cu materii fecale de la caini.

In prezent, nu exista medicament sau chimioterapic disponibil pentru tratamentul infectiei cu Neospora caninum la bovine sau pentru a preveni transmiterea parazitului de la o mama infectata la descendenti.

A fost publicat un studiu privind raspunsul imunologic la un vaccin experimental, dar nu s-a demonstrate si eficacitatea sa in urma unei infectii experimentale de control.

Un vaccin inactivat de Neospora caninum este disponibil comercial in SUA. Totusi, nu s-a demonstrat faptul ca acest vaccin este eficient in prevenirea infectiei verticale sau a avorturilor. Intr-o testare a acestui vaccin in teren, din cele 876 de vaci vaccinate (la doua luni de gestatie) in 25 de ferme de vaci de lapte in Costa Rica, vacile vaccinate au prezentat o rata de avorturi de 11%, iar cele nevaccinate o rata de 21% (eficacitatea vaccinului fiind, astfel de 46%). Pentru fiecare vaca din grupul celor vaccinate, s-a selectat cate o vaca martor, de aceeasi varsta si de aceeasi rasa. Analiza Kaplan-Meier de estimare a timpului pana la avort a indicat ca diferenta intre riscul de avort intre grupurile vaccinate si martor are loc intre 150-200 zile de gestatie, cand rata de avort a vacilor vaccinate a fost semnificativ mai mica.

O testare in teren, in Noua Zeelanda, utilizeaza 2240 vaci gestante din 5 ferme de vaci de lapte, animale selectate pe baza unui istoric de rata de avort mai mare de 8% si pe baza confirmarii prezentei parazitului N. caninum. Vacile au fost vaccinate la 25-45 de zile de gestatie cu rapel 3-4 saptamani mai tarziu. Efectul vaccinului a variat functie de fermele unde a fost testat si functie de serostatusul N. caninum ale vacilor. Eficacitatea medie a vaccinului a fost estimata la 24,6%, dar intr-o ferma de vaci de lapte eficacitatea a fost de 54%.

Un program de vaccinare poate complica insa diferentierea intre animalele infectate natural si cele vaccinate, limitand identificarea primelor.

Tratament

Au fost efectuate cateva studii pentru a se gasi cel mai bun tratament pentru infectiile cu Neospora caninum sau pentru a se limita efectele acestei infectii la speciile afectate. Totusi, nu exista nici un chimioterapic disponibil comercial.

O problema cunoscuta in tratamentul cu medicamente al neosporozei la bovine este aceea a timpului de asteptare la lapte atunci cand medicamentul se utilizeaza la vacile de lapte. Aceasta problema nu este foarte importanta la alte specii, la care durata chimioterapiei are un impact mai mic.

O alta problema, la toate speciile, este reprezentata de rezistenta chisturilor tisulare si a bradizoitilor la medicament, intrucat nu exista garantie de 100% a eficacitatii disparitiei acestor stadii ale parazitului in animale.

Sulfamidele sunt principala grupa de medicamente utilizate pentru tratamentul neosporozei, singure sau in combinatie cu alte medicamente, datorita utilitatii cunoscute in tratamentul toxoplasmozei.

Lindsay şi Dubey (1989) au testat eficacitatea medicamentelor: Lasanocid sodium (0.05 μg/ml), monensin sodium (0.05 μg/ml), piritrexim (0.01 μg/ml), pirimethamine (0.05 μg/ml) si trimethoprim (5.0 μg/ml). Aceste medicamente sunt eficiente in prevenirea dezvoltarii intracelulare a tachizoitilor in culturile de monocite bovine. Tratamentele care utilizeaza combinatii ale sulfamidelor cu trimethoprim sunt capabile sa diminueze semnele clinice sis a previna moartea, dar nu sunt capabile sa instaureze complet sanatatea animalelor infectate.

Intr-un studiu extins, in care 43 agenti chimioterapici au fost testati contra tachizoitilor de N. caninum in culturi celulare, rezultatele au indicat ca unele medicamente prezinta activitate coccidiocida, in timp ce altele actioneaza ca si coccidiostatice.

Separat, un studiu efectuat de Lindsay si col. (1999) a demonstrat eficacitatea tratamentului ce combina 7 sulfamide si 5 inhibitori ai dihidrofolatreductazei/timidilatsintazei (DHFR/TS) contra tachizoitilor de N. caninum in culturi celulare.

Mai mult, a fost testata activitatea decochinatului, un medicament coccidiocid, aratandu-se ca acesta actioneaza rapid asupra stadiilor intracelulare, omorandu-le, la concentratii coccidiocide.

Gottstein si col. (2005) au testat medicamentele toltrazuril si ponazuril pentru a preveni formarea de leziuni cerebrale, utilizand modele pe animale de laborator (soricei), iar detectia de ADN prin PCR s-a redus cu mai mult de 90%.

Eficacitatea medicamentului ponazuril a fost, de asemenea, testate pe vitei infectati experimental cu N. caninum de catre Kritzner si col. (2002) care au constatat ca dupa tratament, parazitii nu sunt detectabili in creier si alte organe, in timp de 50% dintre viteii netratati au devenit PCR pozitivi in creier si muschi.

Pe langa aceasta, concentratiile de anticorpi anti-Neospora dezvoltati dupa infectie sunt semnificativ mai mici, cand se compara cu animalele netratate.

Cu aceste rezultate obtinute, cercetatorii sunt incurajati sa dezvolte chimioterapii eficiente contra neosporozei la bovine.

4.2.2.9. Neospora caninum si posibilele dezvoltari

In prezent, Neospora caninum nu se considera a fi transmisibila la oameni, insa anticorpi specifici anti-Neospora caninum au fost detectati la oameni in diferite locuri de pe glob, dar nu se cunoaste inca semnificatia acestora.

Neospora infecteaza multe specii, inclusive ovine, caprine si cabaline, dar, in prezent, nu este dovedit faptul ca alte specii, diferite de canide, sunt surse majore de transmitere.

Exista un interes deosebit in dezvoltarea unui vaccin eficient utilizabil la bovine contra parazitului Neospora caninum.

Ramamoorthy si col. (2007) au publicat studiile unui studiu asupra unui vaccin in care au utilizat diferite tulpini recombinante de Brucella abortus RB51, modificate pentru a expresa diferite antigene de N. caninum la soriceii vaccinati. Intr-o testare, cand s-a realizat infectarea cu Neospora, toti soriceii martor au murit in termen de 7 zile, dar toti soriceii vaccinati cu oricare dintre cele doua tulpini modificate, expresatoare de antigene Neospora, au supravietuit.

Intr-un alt studiu, vaccinul cu RB51 modificat a fost administrat la soricei de doua ori, la un interval de 4 saptamani. Soriceii nascuti din mame vaccinate au prezentat o reducere a incarcaturii parazitare in creier, comparativ cu cei proveniti din mame martor nevaccinate, atunci cand mamele au trecut prin infectie de control cu N. caninum. Autorii acestor experimente considera ca acestea sunt un pas preliminar in dezvoltarea unui vaccin contra brucelozei si neosporozei la bovine.

4.2.2.10. Concluzii

Progresul substantial in cercetarea stiintifica a condus la imbogatirea cunostintelor privind Neospora caninum la bovine, insa raman inca nelamurite, probleme legate de diagnostic, transmitere, factorii critici de risc si timp si eficacitate a vacinurilor.

Sunt necesare eforturile de cercetare suplimentare pentru a se intelege pe deplin epidemiologia si ecologia acestei boli si pentru a se formula protocoale eficiente de prevenire.

4.2.3. Studiu bibliografic privind metodologiile de diagnostic în neosporoză – P2

4.2.3.1. Diagnosticul serologic şi molecular în neosporoză

Neosporoza, boală parazitară ce afectează preponderent câinele şi bovinele, sporadic şi alte specii de mamifere, este produsă de o coccidie - Neospora caninum, multă vreme confundată cu Toxoplasma. Parazitul, izolat pentru prima dată la câine în Norvegia (Bjerkas şi col., 1984), a fost identificat ca specie Toxoplasma - like, dar distinctă de T. gondii. Câinele este considerat a fi gazda definitivă, rumegătoarele - în principal bovinele, reprezentând gazda intermediară; aceasta poate fi reprezentată şi de cabaline şi rozătoare de laborator (Dubey, 2003a).

Având o prevalenţă de până la 90% în unele efective de taurine, cu transmitere majoră transplacentară, neosporoza determină pierderi economice severe în întreaga lume, prin tulburări de reproducţie, în principal avort. Infecţia vacilor gestante poate fi urmată şi de obţinerea de viţei neviabili - care vor muri în primele săptămâni de viaţă sau viţei cu paralizii incurabile (Collery, 1995).

Diagnosticul neosporozei este complex, incluzând examen clinic, examen parazitologic, examene serologic, histopatologic şi imunohisto-chimic, iar recent şi utilizarea tehnicilor de biologie moleculară (Polymerase-Chain-Reaction).

Spre deosebire de metodele de detectare directă sau indirectă a Neospora caninum în ţesuturile fetale, metodele serologice pot fi utilizate pentru diagnostic la animale în viaţă şi în acest fel oferă informaţii asupra stadiului infecţiei. Prezenţa anticorpilor specifici anti – Neospora în serul femelelor poate fi util nu doar în diagnosticul infecţiei, dar poate de asemenea oferi indicii cu privire la posibilul rol pe care îl are animalul în ciclul biologic sau epidemiologia lui Neospora caninum (Jenkins şi col., 2002).

Actualmente sunt disponibile numeroase tehnici pentru detectarea anticorpilor faţă de Neospora caninum, la viţei, vaci sau câine (tabel 1). Aceste tehnici utilizează tachizoiţi de N. caninum, uscaţi sau fixaţi, în tehnica IFAT sau testul de aglutinare (Neospora agglutination test – DAT. Câteva studii descriu utilizarea tehnicii Western blot pentru diagnosticul infecţiilor cu N. caninum.

Totodată, au fost descrise diferite tehnici ELISA, care utilizează fie tachizoiţi de N. caninum (ca atare sau fixaţi), fie extracte apoase sau detergent-solubile de tachizoiţi, fie antigeni de tachizoiţi încorporaţi în complexe imunostimulatoare (iscoms - immunostimulating complexes) sau antigeni recombinanţi ai tachizoiţilor.

Au mai fost dezvoltate şi descrise câteva teste ELISA de competiţie [competitive inhibition ELISAs (CI-ELISA)], care detectează anticorpii anti N. caninum în ser, la câteva specii de animale - gazdă . Una dintre acestea, testul CI-ELISA, utilizează Ac monoclonali (mAc) pentru a captura antigenul conservat imunodominat de 65 kDa al tachizoiţilor de N. caninum. Această tehnică testează prezenţa anticorpilor anti N. caninum în ser pe baza capacităţii lor de a bloca legarea celui de al doilea Ac monoclonal - marcat enzimatic la proteina capturată de 65kDa.

Tabel 4.2.3.1

Aplicaţii ale testelor serologice specifice pentru diagnosticul neosporozei la câini şi bovine

Testul oferă informaţii despre:	Animal	Aplicarea specifică	Referinţe selectate (metode)
Boală	Bovine	Diagnosticul avortului la bovine	Thurmond şi col., 1997 (IFAT) Pare şi col., 1995 (ELISA)
	Câine	Diagnosticul neosporozei canine	Dubey şi col., 1988b (IFAT) Björkman şi col., 1994 (ELISA)
Infecţie	Bovine	Identificarea bovinelor infectate	Conrad şi col., 1993 (IFAT) Pare şi col., 1995 (ELISA, immunoblot) Packham şi col., 1998; Romand şi col., 1998 (DAT)
	Bovine	Detectarea infecţiilor recente	Bjorkman şi col., 1999 (ELISA)
	Bovine	Identificarea animalelor libere de N. caninum – pentru transferul embrionic la bovine	Baillargeon şi col., 2001 (ELISA)
	Bovine	Detectarea anticorpilor fetusului	Barr şi col., 1995 (IFAT) Reichel and Drake, 1996; Wouda şi col., 1997 (ELISA) Söndgen şi col., 2001 (immunoblot)
	Câine	Identificarea câinilor infectaţi	Bjorkman şi col., 1994 (ELISA, immunoblot) Lindsay şi col., 1990 (IFAT)
Rolul epidemiologic	Câine	Identificarea câinilor care au oochisturi de N. caninum în fecale	McAllister şi col., 1998 (IFAT) Schares şi col., 2001 (IFAT, immunoblot)
	Bovine	Transmiterea verticală	Pare şi col., 1997

Dintre testele serologice, sunt utilizate în prezent, pentru detectarea anticorpilor anti N. caninum, diferite tehnici ELISA, imunofluorescenţă indirectă (IFAT) şi teste de aglutinare (Neospora Agglutination Test). Imunoblottingul este, de asemenea, util în detectarea anticorpilor specifici anti Neospora.

Una dintre cele mai frecvente limitări ale tehnicilor de diagnostic serologic în neosporoză, este aceea că acestea nu pot distinge infecţiile acute de cele latente. În acest sens, testul imunoenzimatic - varianta Elisa de competiţie, care a fost dezvoltat pentru a diferenţia infecţiile recente de cele cronice, la bovine, prin măsurarea indicelui de aviditate (AI), pare să fie metoda promiţătoare pentru a diferenţia avorturile epidemice de cele endemice (Björkman şi col., 1999). Principiul aceste metode constă în faptul că intensitatea de legare a Ac anti- N. caninum creşte odată cu timpul scurs de la infecţie.

Examinarea serologică a vacilor cu avort este un „indicator” al expunerii la infecţia cu N. caninum, diagnosticul cert fiind stabilit prin examinarea histologică a fetusului (Dubey şi col., 2008).

Prezenţa anticorpilor anti N. caninum în serurile de la fetuşi, poate stabili infecţia cu N. caninum, dar rezultatele negative nu constituie obligatoriu un diagnostic negativ, deoarece sinteza anticorpilor la fetus este dependentă de stadiul gestaţiei, gradul de expunere/infecţie şi perioada dintre infecţie şi avort. Chiar şi un nivel scăzut al titrului de 1:25 ar trebui privit ca specific pentru infecţia cu N. caninum, în special la fetuşi (Dubey, 2003 b).

Imunoblotingul, utilizând antigeni specifici N. caninum, îmbunătăţeşte diagnosticul. Deşi serul sanguin sau orice alt fluid de la fetus poate fi folosit pentru diagnostic serologic, lichidul peritoneal pare a fi mai potrivit decât alte lichide. La viţei, serul recoltat înaintea primei alăptări, poate fi folosit pentru diagnosticul infecţiei congenitale.

În cazul testelor serologice, valorile titrului şi absorbanţei sunt dependente de compoziţia antigenului, anticorpi secundari şi alţi reagenţi. Mai mult, titrurile minime trebuie stabilite astfel încât să asigure raportul optim între sensibilitatea şi specificitatea necesare fiecărei situaţii în parte. Vârsta şi categoria animalelor pot de asemenea, să afecteze selectarea titrului minim.

De-a lungul timpului, au fost dezvoltate numeroase teste serologice pentru supraveghere şi diagnostic în efective cu avorturi endemice sau epidemice asociate infecţiei cu N. caninum.

Schares şi col. (2002) au dezvoltat o tehnică ELISA pentru a determina aviditatea anticorpilor IgG faţă de proteina p38 - antigen de suprafaţă (NcSRS2) al tachizoiţilor de N. caninum. În serul vacilor infectate experimental cu N. caninum NC-1, aviditatea specifică p-38 a crescut de la valoarea iniţială de sub 40% la indici cu valori între 50 şi 80% la 23 şi 91 zile p.i. În efectivele cu avorturi endemice, au fost detectaţi în general, indici crescuţi de aviditate ai IgG-ului specific pentru N. caninum. Aceste rezultate şi observaţiile privind asocierea dintre seropozitivitatea vacilor şi cea a urmaşilor lor, a sugerat o transmitere predominant verticală a acestui parazit la animalele efectivului examinat, indicând astfel o infecţie cronică a acestor animale. În contrast, în cazul efectivelor cu avorturi epidemice, nu a putut fi stabilită o asociere între seropozitivitatea vacilor şi a fiicelor lor; IgG p38-specific, determinat în serul vacilor care au avortat, a prezentat, în general, aviditate scăzută. Aceasta indică o transmitere recentă, postnatală, a infecţiei cu N. caninum în efectiv.

Actualmente, măsurile adecvate de control în neosporoză depind în principal de calea predominantă de transmitere într-un efectiv. Astfel că, dezvoltarea unor metode de diagnostic capabile să diferenţieze între primo-infecţie, agravare, re-infecţie şi infecţie cronică este o provocare majoră a serodiagnosticului neosporozei bovine (Aquado-Martinez şi col., 2008).

Testele serologice de aviditate (ELISA şi Western blot) au fost utilizate şi dezvoltate pentru a diferenţia infecţiile acute cu N. caninum (infecţie primară, reinfecţie sau acutizare) de cele cronice, la bovine.

Testul imunoenzimatic - varianta Elisa de competiţie a permis discriminarea între infecţia primară şi cea cronică; toate vacile cu primo-infecţie experimentală au prezentat indici scăzuţi de aviditate la 4 săptămâni p.i., comparativ cu valori crescute de aviditate înregistrate la 20 săptămâni p.i. Totuşi, acest test nu a permis diferenţierea între re-infecţie/ acutizare şi infecţiile cronice (Aguado-Martinez şi col, 2005).

Recent, au fost dezvoltate două tehnici ELISA bazate pe proteine recombinante, care au utilizat proteina imunodominantă NcGRA7 (immunodominant NcGRA7 dense granule protein) şi proteina NcSAG4 – proteina specifică stadiului de bradizoit, pentru a face diferenţiere între infecţiile primare, acutizări, reinfecţii şi infecţii cronice (Aguado-Martinez şi col, 2008). Rezultatele studiului au arătat că nivelul anticorpilor anti-rNcGRA7 ar putea fi un indicator al infecţiei acute (primo-infecţie, reinfecţie sau acutizare), în timp ce prezenţa anticorpilor anti-rNcSAG4 ar putea fi asociată cu infecţia cronică, fiind un bun indicator al stabilirii infecţiei (conversia tachizoiţi-bradizoiţi). De altfel, infecţia primară asociată cu avortul epidemic indus de Neospora, este caracterizată prin detecţia anticorpilor anti rNcGRA7 şi absenţa sau detecţia unor nivele scăzute (apropiate de nivelul minim) a anticorpilor anti rNcSAG4. În contrast, detectarea ambelor tipuri de anticorpi faţă de cele două proteine recombinante, ar putea fi un indicator al acutizării sau re-infecţiei, asociate cu avortul şi/sau transmiterea verticală în efectiv (avort endemic asociat infecţiei cu Neospora).

Astfel, ambele teste oferă informaţii suplimentare faţă de testele convenţionale de aviditate şi, în consecinţă, îmbunătăţesc diagnosticul neosporozei la bovine.

Tehnicile moderne de biologie moleculară, bazate pe Polymerase-Chain-Reaction (PCR) reprezintă instrumente foarte utile diagnosticului neosporozei la mamifere, mai ales în cazurile de co-infecţie cu Toxoplasma sau alte organisme asemănătoare. Folosind tehnica PCR, regiunile specifice ale ADN-ului de N. caninum sunt vizate şi amplificate, pentru a permite identificarea precisă în laborator.

Asemănările morfologice şi reactivitatea serologică încrucişată între N. caninum şi alţi paraziţi înrudiţi – Toxoplasma gondii, au condus la frecvente erori de diagnostic a neosporozei ca toxoplasmoză.

Toxoplasma gondii şi Sarcocystis cruzi sunt două protozoare care ar trebui luate în considerare la diagnosticul diferenţial al avorturilor provocate de protozooze la bovine. Tehnicile de imunohistochimie şi detectarea ADN-ului parazitului prin tehnici PCR pot face diferenţierea acestora faţă de N. caninum. Sarcocystis cruzi formează schizonţi în endoteliul vascular şi este rar găsit (<0,1%) în creierul fetal, în timp ce N. caninum este de regulă localizat în ţesuturi extravasculare. În plus, nu se întâlnesc schizonţi imaturi în infecţiile cu N. caninum, în contrast cu infecţiile cu S. cruzi. Infecţiile cu T. gondii la fetuşi de bovine sunt rare (Canada şi col., 2002).

Unele tehnici bazate pe PCR, folosind gena pentru proteinele 14-3-3, s-au dovedit a fi utile pentru diagnosticul molecular al neosoporozei (Lally şi col., 1996.).

De asemenea, tehnici bazate pe PCR au fost folosite pentru determinarea prevalenţei infecţiilor cu N. caninum şi co-infecţiei cu Toxoplasma gondii, la populaţii de animale infectate natural. Hughes şi col. (2006), utilizând tehnica nested-PCR şi primeri specifici din regiunea Nc5 a ADN pentru N. caninum şi SAG1 pentru Toxoplasma gondii, au investigat populaţiile de şoareci (Mus musculus), şobolani (Rattus norvegicus) şi miei – avortoni (Ovis aries), găsind o incidenţă scăzută a infecţiei la şoareci şi şobolani (3%, respectiv 4,4%), în timp ce în creierul mieilor avortaţi incidenţa lui N. caninum a fost de 18,9%.

Recent, Ghalmi şi col. (2008) au aplicat pentru detecţia moleculară a N. caninum la câine, 3 sisteme diferite de Real-time PCR, toate amplificând regiunea NC5 a ADN. Prevalenţa globală a fost de 32,3%. Comparând rezultatele testelor PCR cu rezultatele testelor serologice (IFAT) s-a arătat că dintre cele 28 de rezultate pozitive prin PCR, doar 9 au fost pozitive prin IFAT şi că 8 dintre probele seropozitive au fost negative prin PCR.

Astfel, se constată că testele serologice pot evidenţia existenţa infecţiei în efectiv, dar nu pot stabili exact tipul şi gradul infecţiei, iar metodele PCR ar trebui îmbunătăţite, îndeosebi în ce priveşte sensibilitatea şi problemele datorate inhibitorilor.

4.2.3.2. Diagnosticul histopatologic şi imunohistochimic în neosporoză

Neosporoza este o boală parazitară produsă de protozoarul Neospora caninum (Nc), fiind o cauză importantă a avorturilor la taurine. Leziuni de tip chistic produse de Neospora caninum au fost descrise pentru prima dată în 1984, în Norvegia, la căţeluşii cu semne clinice de encefalită. Iniţial, această formă de boală a fost atribuită toxoplasmozei, dar în 1988 s-a identificat şi tipizat protozoarul inplicat în apariţia maladiei, acesta aparţinând genului Neospora, specia Neospora caninum. Ulterior boala a început să fie amplu studiată pe plan mondial (Dubey, 1992; Dubey şi Lindsay, 1996; Georgieva şi col., 2006).

Neospora caninum este deosebit de patogen pentru taurine şi câine, dar poate produce boala şi la ovine, caprine, cabaline şi căprioare (Dubey, 2003a; Georgieva şi col., 2006).

Infecţiile cu Neospora caninum reprezintă una dintre principalele cauze ale avortului la taurine în foarte multe ţări, iar pierderile economice datorate tulburărilor de reproducţie şi scăderii productivităţii sunt semnificative (Anderson şi col., 1991; Barr şi col., 1991a).

Ciclul biologic al protozoarului Neospora caninum presupune participarea a două gazde: definitivă şi intermediară. Câinele şi coiotul au rol de gazdă definitivă, iar taurinele, caprinele, cabalinele şi căprioarele de gazdă intermediară. Anticorpi anti – N. caninum au fost detectaţi şi în serul bivolilor, coiotului, vulpilor şi cămilelor, ceea ce sugerează că aceste specii joacă de asemenea rol de gazde intermediare. Câinele îndeplineşte atât rol de gazdă definitivă cât şi de gazdă intermediară (Barber şi Trees, 1996; Dubey şi col., 1988a; Georgieva şi col., 2006).

Ciclul vital al protozoarului N caninum conţine trei forme cu capacitate infectantă: tachizoitul, bradizoitul (prezent în chisturile tisulare) şi oochistul. Tachzoiţii şi bradizoiţii (respectiv chisturile tisulare) sunt detectaţi în gazdele intermediare.

Câinii, ca gazde definitive, se pot infecta prin consumarea învelitorilor fetale, a placentei sau a altor organe care conţin tachizoiţi sau chisturi tisulare de la fetuşii avortaţi. Gazdele intermediare se pot infecta prin consumul de furaje sau apă contaminate cu oochisturi de Neospora caninum eliminate de gazdele definitive (Georgieva şi col., 2006).

Între metodele de diagnostic folosite în neosporoză, investigaţiile histopatologică şi imunohistochimică sunt deosebit de importante, contribuid decisiv la stabilirea diagnosticului de neosporoză. Metodele sunt folosite atât în cazul avortonilor, cât şi postmortem, la animalele care au prezentat semne clinice de boală (Barr şi col., 1991a; Lindsay şi Dubey,1989; Pescador şi col., 2007).

Aspectele morfologice din neosporoză au un grad de similitudine la speciile afectate, dar există şi aspecte particulare, cu grad mare de specificitate (Barr şi col., 1990; Dubey şi Lindsay, 1996).

În general, Neospora caninum determină moarte celulară şi tisulară în cîteva zile după infecţie, datorită replicării active a tachizoiţilor. Aceste aspecte sunt mai grave în ţesutul nervos şi în cel muscular datorită distrugerii masive a celulelor nervoase de către paraziţi şi a propagării efectului de către celulele infectate. Chisturile tisulare, prezente cel mai adesea în ţesutul nervos, sunt înconjurate de reacţie celulară. De cele mai multe ori, în jurul chisturilor tisulare vechi, degenerate, se formează o reacţie granulomatoasă, cu celule epitelioide şi gigante multinucleate, ca răspuns al ţesutului gazdă la distrucţia suferită şi a implicării unui agent patogen greu fagocitabil (Dubey şi col., 1988a; Dubey, 2003a ).

La câine, neosporoza poate îmbrăca o formă localizată sau o formă generalizată, cu afectarea tuturor organelor, inclusiv a pielii (Barber şi Trees,1996; Dubey şi col., 2005).

Din punct de vedere clinic boala se manifestă la căţeii infectaţi transplacentar prin pareze şi paralizii, poliradiculită şi polimiozită. La câinii adulţi infectaţi cu N. caninum cel mai adesea sunt semnalate leziuni de meningomieloencefalită, dar pot fi detectate şi leziuni de miocardită, responsabile de moartea animalelor, dar şi polimiozită, dermatită şi pneumonie (Meseck şi col., 2005).

Diagnosticul postmortem de neosporoză se bazează pe detectarea paraziţilor la câinii afectaţi. După Dubey şi col., (1988b) cele mai reprezentative leziuni, caracteristice pentru neosporoză sunt focarele de necroză din SNC şi din ficat, granuloamele cu diametru mai mare de 1 cm din organele parenchimatoase, striurile alb-gălbui din musculatură, în special diafragmatică, atrofia cerebrală şi dermatita ulcerativă. Pentru confirmarea diagnosticului sunt necesare investigaţii imunohistochimice, cu folosirea antigenelor specifice.

Şi la câinii cu neosporoză neonatală au fost depistate leziuni în SNC şi în musculatura scheletică. În SNC au fost identificate leziuni de encefalită multifocală, cu necroză discretă, glioză şi manşoane perivasculare reprezentate de celularitate de tip mononuclear. Asociat acestora au fost depistate chisturi parazitare, integre sau degenerate. Cele mai severe leziuni au fost evidenţiate în cortexul cerebral. Leziuni de miozită, caracterizate prin dilacerarea şi fragmentarea miocitelor, fibroză interstiţială şi infiltrat mononuclear au fost observate în special în gastrognemieni, musculatură abdominală, diafragm şi cvadriceps femural. Chisturi parazitare, dar fără reacţie inflamatorie asociată, au fost decelate în musculatura maseterină. În unele cazuri căţeluşii necropsiaţi au prezentat megaesofag şi leziuni severe de esofagită, cu prezenţa chisturilor parazitare în fibrele musculare locale (Barber şi Trees,1998; Dubey şi col., 2005).

La examenul histologic pot fi decelate leziuni de encefalomielită nesupurativă, poliradiculonevrită, miozită şi fibroză a musculaturii. Encefalomielita se caracterizează prin degenerări axonale, infiltrat inflamator şi noduli gliali, atât în substanţa albă cât şi în cea cenuşie. Uneori, în formele subclinice, pot fi observate doar focare de meningoencefalită granulomatoasă. Decelarea tachizoiţilor în focarele inflamatorii este esenţială pentru stabilirea etiologiei. Se pare că Neospora caninum induce un proces inflamator mai evident, comparativ cu Toxoplasma gondii, dar pentru confirmare sunt necesare investigaţii serologice sau imunohistochimice. Un indiciu în favoarea neosporozei ar fi acela că pe lângă leziunile din SNC apar şi leziuni de flebită şi dermatită. La subiecţii cu neosporoză pot fi întâlnite şi alte leziuni, neînsoţite de manifestări clinice, dintre care sunt de menţionat miocardita, pneumonia şi hepatita limfo-histiocitară (Barber şi Trees,1996; Barber şi Trees,1998; Dubey şi col., 2005; Georgieva şi col., 2006).

La taurine, protozoarele din genul Neospora pot determina avort şi semne nervoase la viţeii nou-născuţi. Neosporoza este o cauză majoră a avorturilor şi la animalele sălbatice. Fetuşii infectaţi cu N. caninum prezintă leziuni de encefalită multifocală şi leziuni inflamatorii în ţesuturi precum musculatură scheletică, miocard, ficat, pulmon, rinichi, placentă (Dubey, 2003a; Wouda şi col., 1997). Valoarea diagnostică este cu atât mai mare cu cât vor fi examinate mai multe ţesuturi (Otter şi col., 1997). Cu toate că leziunile atribuite neosporozei pot fi decelate în mai multe ţesuturi şi organe, creierul fetal este cel mai frecvent afectat.

Într-un studiu întreprins de Wouda şi col. (1997) pe 80 de fetuşi cu neosporoză confirmată, tachizoiţi de N. caninum au fost identificaţi imunohistochimic în proporţie de 85% în creier, 14% în cord şi 26% în ficat.

Depistarea parazitului în ţesuturile avortonilor este esenţială în stabilirea diagnosticului de neosporoză la femelele care au avortat (Anderson şi col.,1991; Thilsted şi Dubey,1989). În acest sens se recoltează fragmente de ţesut fetal din encefal, cord, pulmon, rinichi, ţesut muscular scheletic, placentă. Cu toate că leziunile datorate neosporozei sunt prezente în diferite organe, creierul este cel mai frecvent afectat. Leziunile de encefalită au caracter localizat, putând fi observate focare de necroză şi hemoragie. Valoarea diagnosticului este mai mare când sunt examinate mai multe ţesuturi. La nivelul miocardului, dar şi în musculatura scheletică sunt descrise leziuni inflamatorii de tip limfohistiocitar. Ocazional, în ficat pot fi decelate focare de necroză şi leziuni inflamatorii de tip limfohistiocitar, cantonate preponderent în spaţiul porto-biliar, iar în pulmon leziuni de pneumonie interstiţială limfohistiocitară (Anderson şi col.,1991; Barr şi col.,1991b).

În urma unor studii întreprinse pe avortoni de taurine, Dubey şi col. (1990) a decelat leziuni microscopice în cord, ficat şi creier. Leziunile miocardice au fost pentru prima dată descrise la viţeii avortaţi şi constau în focare de edem şi hemoragie, necroză a miocitelor şi infiltrat neutrofilic şi celule mononucleare în jurul fasciculelor Purkinje, dar şi leziuni de pericardită difuză. În miocardocite şi ocazional în fasciculele Purkinje au fost evidenţiaţi numeroşi tachizoiţi. În substanţa albă din encefal au fost evidenţiate leziuni multifocale de necroză (leucoencefalomalacie), necroză a vaselor de sânge şi manşoane perivasculare cu celule mononucleare. În neuroni au fost evidenţiaţi tachizoiţi, iar bradizoiţi au fost evidenţiaţi într-un chist tisular decelat în encefal. Tachizoiţii din encefal au fost identici din punct de vedere ultrastructural cu cei din miocard. Leziunile hepatice au constat în necroză hepatocitară în jurul venei centrolobulare. Cauza morţii s-a stabilit a fi insuficienţa cardiacă determinată miocardita generată de N. caninum.

Thilsted şi Dubey (1989) au remarcat că boala se traduce prin leziuni multifocale de necroză uneori decelabile macroscopic, alteori doar microscopic. Sunt afectate diferite ţesuturi şi organe, dar ţesutul nervos şi muscular sunt constant afectate. În encefal şi măduva spinării pot fi observate microfocare de necroză, însoţite de modificările care definesc inflamaţiile nesupurative din SNC, respectiv glioză, noduli gliali şi uneori manşoane perivasculare alcătuite din celule mononucleare. Localizarea focarelor de necroză este randomizată, iar uneori se poate remarca un debut de calcificare distrofică în focarele respective. În musculatură pot să apară zone de fibroză şi calcificare, în special în diafragm, iar în miocard se remarca cel mai adesea infiltrat difuz mononuclear. În ţesutul nervos au fost decelaţi şi paraziţii, fără însă a fi observaţi în miocard sau în musculatura scheletică. Au fost întâlnite şi cazuri în care, leziunilor menţionate li s-au adăugat şi hepatomegalie, pneumonie şi ramolisment cenuşiu al ţesutului nervos.

Ovinele gestante sunt deosebit de sensibile la infecţia experimentală cu N. caninum. În urma infecţiilor experimentale la oile cu gestaţie incipientă, avortul a survenit la 25 – 30 de zile post-infecţie, fiind decelate leziuni la avortoni în encefal, măduva spinării, musculatură şi placentă. În ţesuturile oilor care au avortat nu au fost decelate leziuni. Dacă infecţia survine în fazele avansate ale gestaţiei (după a 65 zi) oile pot avorta sau pot făta miei subdezvoltaţi sau chiar clinic sănătoşi. La aceştia pot fi decelate leziuni în creier, placentă, cord, ficat şi pulmon. Chisturi tisulare au fost decelate numai în encefal. Leziunile de encefalită întâlnite la avortoni au fost multifocale, constând în focare hemoragice sau necrotice, glioză şi manşoane perivasculare de tip mononuclear, localizate în substanţa albă şi cenuşie din cerebrum şi cerebel. Leziuni similare pot fi decelate uneori şi în măduva spinării. Ca şi la avortonii taurinelor şi la mieii avortaţi au fost decelaţi tachizoiţi în SNC. În musculatura membrelor au fost întâlnite leziuni de miozită caracterizată prin mici focare de necroză a rabdomiocitelor şi infiltrat cu celule mononucleare în perimisium. Focare de proliferare mononucleară au fost decelate şi în musculatura limbi. Leziunile de placentită au constat în necroză şi mineralizare a cotiledoanelor, însă fără identificarea paraziţilor (Georgieva şi col., 2006).

În vederea examenului histopatologic fragmentele de ţesut recoltate se fixează în soluţie de formaldehidă 10%, se includ la parafină, se secţionează la microtom, după care pot fi colorate bicromic (hematoxilină-eozină) sau tricromic (Masson) şi examinate la microscop (Dubey şi col.,1990; Otter şi col.,1997; Pescador şi col.,2007; Thurmond şi col., 1999).

Diagnosticul imunohistochimic permite identificarea tachizoiţilor şi bradizoiţilor de N caninum în ţesuturi cu ajutorul anticorpilor monoclonali (Lindsay şi Dubey, 1989; Pescador şi col.,2007; Barteles şi col., 2006).

Tehnica de bază folosită în acest scop a fost pusă la punct şi descrisă pentru prima dată de către Lindsay şi Dubey în 1989, fiind cunoscut ca testul complex avidină-biotină-peroxidază (testul ABPC) (Lindsay şi Dubey, 1989).

Tehnica imunohistochimică a fost şi este folosită în studiile epidemiologice ale neosporozei, în studierea gazdelor definitivă şi intermediară, precum şi în studierea ciclului biologic al parazitului.

Cu toate că este o tehnică laborioasă şi presupune mai multe etape de lucru, rezultatele sunt încurajatoare şi astfel a reuşit să se impună pe plan mondial.

Într-o primă etapă se recurge la producerea anticorpilor specifici. În acest sens au fost izolaţi tachizoiţi de Neospora caninum de la câini infectaţi natural şi/sau experimental, care au fost menţinuţi prin pasaje seriate pe culturi celulare, în vederea imunizării iepurilor folosiţi pentru producerea de ser anti-N. caninum. Titrul de anticorpi decelat prin imunofluorescenţă indirectă a fost de 1:25.800. În paralel au fost imunizaţi iepuri şi cu oochişti de T. gondii pentru producerea de ser anti-T. gondii. Titrul acestui ser a fost de 1: 3.200. Pentru detectarea legăturilor specifice antiserului de iepure s-a utilizat kitul IgG anti-iepure avidin-biotin-peroxidaza – ABPC (Vector Laboratories Inc, California, USA).

Fragmentele de ţesut recoltate au fost fixate în soluţie de formaldehidă 10%, incluse la parafină şi secţionate la 5 – 8 microni. După secţionare s-a recurs la deparafinare cu xilen, rehidratare cu alcool etilic şi tratare cu peroxid de hidrogen 3% în metanol timp de 30 de minute, pentru a inhiba activitatea peroxidazei endogene. Secţiunile au fost spălate în soluţie salină de fosfat tamponat, cu pH 7,2, cu un conţinut de 0,1% albumină serică bovină cristalină (PBSA), apoi incubate în ser diluat de capră (Vector Laboratories Inc, California, USA). Timpul de incubare este de 20 de minute pentru a bloca legăturile Ag-Ac nespecifice şi de o oră pentru antiserul specific.

Serul anti-N. caninum a fost folosit la o diluţie de 1:1000 în PBSA, iar serul anti-T. gondii la o diluţie de 1:500 în PBSA. Anticorpii nefixaţi au fost înlăturaţi prin spălarea secţiunilor în PBSA. Secţiunile au fost incubate cu IgG anti-iepure biotinilat de capră (Vector Laboratories Inc, California, USA) timp de 30 de minute, apoi spălate în PBSA şi din nou incubate în reagent avidin-biotin-peroxidază timp de 30 de minute. Apoi secţiunile au fost din nou spălate în PBSA şi incubate timp de 5 minute în soluţie de diaminobenzidină-peroxid de hidrogen. Ulterior secţiunile au fost spălate în apă distilată, contracolorate cu hematoxilină, deshidratate în alcool etilic şi apoi montată lamela.

Specificitatea ţesutului a fost evaluată prin testarea serului de iepure anti-N. caninum şi anti-T. gondii pe unii paraziţi cunoscuţi (Sarcocystis spp, Hammamondia hamamondi, Besnoitia jellisoni etc.), pentru care s-a recurs la infecţii experimentale.

Rezultatele obţinute au promovat această tehnică în vederea diagnosticării neosporozei, fiind larg folosită pe plan mondial. Testul ABPC permite diferenţierea N. caninum de T. gondi în ţesuturi, iar reacţii încrucişate între N. caninum şi alţi paraziţi nu au fost observate.

Serul anti-N. caninum reacţionează cu tachizoiţii şi bradizoiţii de N. caninum. Tachizoiţii se colorează mult mai intens decât bradizoiţii. S-a colorat de asemenea peretele chisturilor tisulare din SNC. Nu au fost remarcate reacţii încrucişate cu alţi paraziţi. Ţesuturile de la câinii infectaţi natural cu N. caninum au dat reacţie pozitivă cu antiserul N. caninum şi reacţie negativă cu antiserul T. gondii.

Antiserul T. gondii a dat reacţie cu tachizoiţii de T. gondii şi cu bradizoiţii de T. gondii şi de Hammondia hammondi. Tachizoiţii de T. gondii şi de H. hammondi s-au colorat mult mai intens decât bradizoiţii aceloraşi specii. Aceasta se explică prin faptul că T. gondii şi H. hammondi au relaţii de antigenitate, iar vaccinarea împotriva H. hammondi protejează şi împotriva expunerii la T gondii.

Ţesuturile recoltate de la câinii infectaţi cu T. gondii au dat reacţie cu serul anti-T.gondii, fără a da reacţie cu antiserul N. caninum. Nu a fost observată nicio reacţie împotriva altor paraziţi.

În paralel s-a urmărit şi compatibilitatea diferiţilor fixatori cu testul ABPC. În acest scop au fost folosiţi diferiţi fixatori: formaldehidă, Carnoy, Bouin, şi Helly în care au fost fixate fragmente de ficat de şobolan infectat experimental cu N caninum. S-a constatat că cele mai bune rezultate s-au obţinut în cazul folosirii formaldehidei, a fixatorului Carnoy şi Bouin. Fixatorul Carnoy a oferit cea mai intensă colorare a tachizoiţilor (Lindsay şi Dubey, 1989).

În timp, tehnica imunohistochimică a suferit modificări şi îmbunătăţiri, în principal datorită progreselor tehnologice şi automatizărilor survenite în domeniul aparaturii folosite în investigaţiile de laborator din domeniul medical. În prezent, această tehnică se poate realiza cu ajutorul unui imunostainer automat (Vantana Inc), cu acţiune prin capilaritate. Pentru identificarea antigenelor parazitare se foloseşte tot metoda imunoperoxidazei cu Avidină-Biotină-Peroxidază (ABC) (Vector Elite ABC-peroxidaza), aplicată pe fragmente de ţesut inclus la parafină. Secţiunile sunt deshidratate, tratate enzimatic cu protează IV 0,1% şi incubate cu ser normal de cal 5%. Ca antigen primar se foloseşte serul hiperimun de capră diluat 1:2000. Imunomarcarea se evidenţiază cu substrat de amino-etil-carbazol, iar secţiunile sunt contracolorate cu hematoxilină Mayer şi apoi examinate la microscop (Pescador şi col., 2007; Ramos-Vara şi Beissenherz, 2000).

Ca probă martor pozitivă se poate folosi ţesut nervos fixat în soluţie de formaldehidă recoltat de la şoareci cărora le-au fost inoculate NC-1 derivate din tachizoiţi de Neospora caninum. Martorul negativ este reprezentat de un anticorp primar cu diluţie similară cu a serului de capră anti- N. caninum, folosit pentru toate ţesuturile examinate.

În prezent, confirmarea infecţiei cu Neospora caninum prin imunohistochimie este considerată ca având o sensibilitate redusă, cele mai bune rezultate obţinîndu-se la examinarea creierului fetal, dar şi în alte organe: pulmon, rinichi, cord, ficat, musculatură scheletică. Într-un studiu făcut pe 80 de avortoni cu neosporoză au fost identificaţi imunohistochimic tachizoiţi în 85% din cazuri în creier, 14% în cord, 26% în ficat (Bartels şi col., 2006).

Cu toate că metodele histopatologică şi imunohistochimică sunt folosite în continuare în diagnosticul neosporozei la avortoni, pentru detectarea contaminării cu Neospora caninum a fetuşilor se recurge tot mai frecvent la testul PCR, considerat ca fiind mai sensibil decât imunohistochimia (Baszler şi col., 1999; Collantes-Fernandez şi col., 2002).

4.2.3.3. Concluzii

Actualmente, au fost validate şi sunt disponibile numeroase tehnici pentru diagnosticul neosporozei; fiecare dintre aceste metode de diagnostic prezintă avantaje şi dezavantaje. Astfel, în alegerea metodologiei de diagnostic a avorturilor asociate cu Neospopra caninum la bovine şi a infecţiilor cu N. caninum trebuie să se ţină cont de faptul că N. caninum este un parazit bine adaptat la bovine şi se transmite transplacentar cu o frecvenţă mare. Totodată, numeroase date indică faptul că, în cele mai multe cazuri, infecţia fetală nu conduce obligatoriu la avort.

Pentru a evita erorile de diagnostic (inclusiv diagnosticul fals negativ), nu este suficient doar diagnosticul serologic, care să evidenţieze infecţia fetală sau maternală; acesta trebuie coroborat cu diagnosticul morfo-histo-patologic şi supraveghere epidemiologică a efectivelor de animale.

4.3. Întreţinerea “in vitro” a unei suşe de N. caninum

Pe plan internaţional se cunoaşte că utilizarea de culturi celulare reprezintă un mod eficient de a cultiva formele vegetative ale diferitelor protozoare. Pentru tachizoiţii de Neospora caninum această tehnică, de cultivare pe culturi celulare, este des utilizată fiind folosită în marile laboratoare din Statele Unite şi ţările europene.

În România în momentul actual singurele modalităţi de a întreţine şi cultiva unele suşe de protozare se realizează prin inoculare la animale de laborator, embrioni de găină.

4.3.1. Material şi metodă

4.3.1.1. Scop

Obiectivul principal urmărit în cadrul experimentului a fost acela de a pune la punct unele tehnici de obţinere a materialului antigenic de Neospora caninum prin utilizarea tehnicii de cultivare pe culturi celulare cu utilizarea ulterioară a acestuia în cadrul tehnicilor serologice de diagnostic (ELISA sau tehnica imunofluorescenţei indirecte) sau ca şi material biologic de inoculat în cadrul unor infecţii experimentale de laborator.

4.3.1.2. Material biologic

Pentru realizarea experimentului s-a folosit linia celulară Vero (fibroblaste endoteliale renale de maimuţă) şi suşa de Neospora caninum N.C.1.

Experimentul a constat în cultivarea liniei de celule Vero neinfectate în monostrat, acestea servind ca substrat de dezvoltare a parazitului, şi în paralel cu aceasta cultivarea şi inocularea tachizoiţilor de N. caninum pe substratul celular.

4.3.1.3. Cultivarea celulelor Vero

Materiale necesare: flacoane Cole de 25 ml; mediu de cultură RPMI–1640; ser fetal bovin; antibiotice (penicilină, streptomicină); tripsină 10%, tampon fosfat salin (PBS); ser fiziologic (SF); apă distilată; colorant Tripan-Blue; soluţie Giemsa; dimetilsulfoxid (DMSO); lame si lamele; pipete mecanice; vârfuri pentru pipetă mecanică sterile; cameră de numărat; criotuburi; container cu azot lichid; termostat; hotă sterilă; centrifugă; recipiente speciale pentru colectarea deşeurilor contaminate; microscop ranversat (Olympus IX51); cameră foto digitală (Olympus DP10), ataşată unui microscop optic (Olympus BX41).

Compoziţia mediului de cultivare: RPMI–1640; ser fetal bovin 10%; penicilină 100 UI/ml; streptomicină 100µg/ml; aminoacizi neesenţiali 1%.

Compoziţie PBS: NaCl 8 g/L; KCl 0,2 g/L; K₂HPO₄ 0,2g/L; NaHPO₄ X 2H₂O 1,44g/l; H₂O 1L.

Transportul materialului biologic de import a fost realizat în flacoane Cole, umplute complet cu mediul de cultură, pentru a evita desprinderea monostratului celular datorită manevrărilor. Flacoanele au fost prevăzute cu dopuri fără orificii speciale pentru aerisire şi nu s-au realizat condiţii speciale de temperatură, umiditate sau alţi parametri ambientali.

Pasarea celulelor Vero

Cultura de celulară Vero ce urmează a fi pasată se examinează la microscop pentru determinarea momentului optim de efectuare a acestei manopere. Examinarea s-a realizat la microscopul optic cu obiectiv 20X, şi s-a urmărit gradul de multiplicare a celulelor. Momentul optim de pasare s-a considerat a fi atunci când monostratul devine confluent, ocupând în întregime partea ventrală a vasului de cultivare.

Tehnică

Primul pas a fost repezentat de evacuarea mediului de creştere de pe monostrat, avându-se grijă a se preveni desprinderea acestuia. Evacuarea se face prin vărsare simplă, fără agitare prealabilă şi cu atenţie sporită, evitându-se posibile contaminări prin prelingerea accidentală a unor eventuale picături pe marginile orificiului recipientului. Pentru înlăturarea în întregime şi a ultimelor rămăşite ale mediului de cultivare utilizat s-a recurs la limpezirea flaconului cu monostratul de celul Vero cu 5-10 ml PBS. Înlăturarea completă a mediului de cultură vechi este un pas foarte important şi imperios a fi realizat foarte temeinic, cunoscându-se faptul că mediul de creştere are proprietatea de a inactiva efectul proteinolitic al tripsinei care ulterior urmează a fi adăugată.

Următorul pas a fost reprezentat de desprinderea monostratului de pe suprafaţa flaconului de cultură Cole cu ajutorul unei substanţe proteolitice. În acest sens s-a adăugat 1 ml Tripsină 10%, care a fost activată prin menţinerea la 37˚C, timp de 10 minute la termostat. După acest interval de timp, se verifică prin examinare la microscop gradul de detaşare a monostratului şi de individualizare a celulelor. Se consideră oportună întreruperea activităţii proteolitice a tripsinei atunci când toate celulele sunt complet desprinse de partea ventrală a recipientului şi când ele se desprind din conglomeratele care se formează. Pentru a favoriza efectul desprinderii celulare se poate interveni mecanic prin agitarea energică a recipientului. Atunci când monostratul celular este desprins şi majoritatea celulelor sunt individualizate se intervine pentru neutralizarea efectului tripsinolitic şi astfel se stopează reacţia. Această manoperă constă în adăugarea a 6 ml de mediu de cultivare proaspăt. Se omogenizează foarte bine obţinându-se astfel o suspensie de celule pretabile a fi pasate în acest stadiu.

Datorită faptului că numărul de celule mature ajunse în monostrat confluent în vechile recipiente de cultivare este prea mare pentru a fi pasat în întregime într-un singur recipient nou, se impune ca distribuirea acestor celule să se realizeze în trei sau chiar patru flacoane Cole noi. În acest mod se realizează nu doar menţinerea culturii celulare cât şi multiplicarea acesteia, efect dorit, fiind necesară obţinererea unor cantităţi mari de substrat celular. Se utilizează astfel trei flacoane Cole noi în care se distribuie câte 13 ml de mediu de cultivare proaspăt, la care se adaugă câte 2 ml din suspensia de celule obţinută prin tripsinizarea culturii în monostrat, astfel că în final fiecare flacon nou va conţine 15 ml RPMI şi câte o treime din numărul de celule Vero proaspăt tripsinizate.

4.3.1.4. Cultivarea tachizoiţilor de Neospora caninum

În paralel au fost întreţinute culturi celulare infectate cu tachizoiţi de N. caninum, pentru obţinerea materialului antigenic.

Momentul optim al pasării tachizoiţilor de N. caninum se stabileşte prin examinarea la microscop la fiecare 24 de ore şi depistarea fazei în care fenomenul de distrucţie celulară a monostratului celular este de aproximativ 70%.

Din suspensia cu tachizoiţi se inoculează câte 1 ml în unul din flacoanele proaspăt pasate pasate cu celule Vero.

Flacoanele cu celulele neinfectate şi infectate au fost întreţinute în incubator la 37°C, cu o concentraţie de 5% CO_2, riguros controlată şi umiditate constantă de 95%. Pe fiecare flacon s-a făcut identificarea cu foarte multă precizie, notându-se data la care s-a realizat pasajul celular, numărul pasajului, tipul de celule infectate, tipul suşei de paraziţi şi dacă flaconul respectiv a fost sau nu inoculat cu tachizoiţi de N. caninum.

Manoperele de laborator s-au efectuat respectându-se cu stricteţe regulile de sterilitate. Viabilitatea celulelor a fost verificată prin efectuarea testului Tripan-Blue. Acesta s-a realizat în decursul primelor pasaje.

4.3.2. Rezultate

Materialul biologic (formele vegetative de N. caninum şi celule Vero), deşi în timpul transportului (72 ore) nu a beneficiat de condiţii speciale (temperatură, presiune, CO₂, umiditate), a rămas viabil la momentul începerii experimentului. Starea fiziologică a celulelor Vero a fost verificată în laborator prin testul Tripan-Blue, un procent de 99% celule Vero fiind viabile, dovedind gradul mare de rezistenţă al acestora la condiţiile dificile de transport.

În mediul de cultură utilizat (RPMI) nu a fost adăugat piruvat de sodiu, aşa cum cerea tehnica originală, aceasta demonstrând că această componentă, cu rol în respiraţia celulară, nu este un factor indispensabil în supravieţuirea şi multiplicarea celulelor Vero.

În etapa de multiplicare şi pasare a celulelor Vero o etapă importantă o reprezintă depistarea momentului optim de efectuare a pasajului, care de obicei se realizeză atunci când celule sunt în monostrat. Orice întârziere, uneori chiar şi doar de câteva ore, duce la apariţia fenomenului de îmbătrânire celulară. Primele semne de îmbătrânire celulară constatate sunt apariţia efectului de granulare a celulelor şi suprapunerea acestora, astfel că monostratul îşi pierde structura obişnuită, devine pluristrat în unele zone, cu împiedicarea dezvoltării normale a celulelor. Un alt efect negativ care poate să apară este acela al acidifierii mediului de cultivare, fenomen foarte periculos, deoarece acesta devine impropriu în a asigura metabolismul normal celular, devenind citotoxic. Totodată celulele tinere au o viabilitate mult crescută faţă de celulele îmbătrânite, concretizată printr-o capacitate mult crescută de aderare la o nouă pasare precum şi o viteză de multiplicare accelerată.

La controlul microscopic al culturilor celulare infectate cu N. caninum, repetat la fiecare 24h, s-a vizualizat prezenţa tachizoiţilor infectanţi în diferite faze de multiplicare. În spaţiile libere, extracelulare, s-au observat tachizoiţi individuali, iar intracelular datorită multiplicării prin endodiogenie (fenomen de multiplicare asemănător formelor vegetative a lui T. gondii), aceştia au fost dispuşi în pereche (Fig. 4.3.1.).

După 2 zile de cultivare, s-a observat că o parte din celule (aproximativ 30%) erau încă cu membrana celulară intactă, dar cu prezenţa formelor tachizoidale la interior. În jurul acestor celule se evidenţiază prezenţa tachizoiţilor liberi de N. caninum, care prezintă mişcări active, unii dintre ei fiind în imediata apropiere a celulelor rămase încă intacte, iar alţii fiind deja în diferite faze de penetrare celulară. În interiorul celulelor infectate tachizoiţii se găsesc dispuşi pereche, aşezare datorată multiplicării prin endodiogenie a acestora. Stabilirea momentului optim de pasaj al tachizoiţilor de N. caninum reprezintă de asemenea un moment important al obţinerii unor cantităţi mari de material antigenic. Dacă pasajul nu se realizează la timp, există riscul ca tachizoiţii să îşi piardă viabilitatea. Aceasta se concretizează prin incapacitatea acestora de a mai realiza penetrarea şi multiplicarea intracelulară.

Cunoscându-se caracterul strict intracelular de reproducere şi existenţă al protozoarului, este evident că lipsiţi de capacitatea de a mai pătrunde intracelular cultura este compromisă. Semnele îmbătrânirii tachizoidale se pun în evidenţă prin faptul că aceştia manifestă o diminuare evidentă a mobilităţii, devenind aproape inerţi, totodată suferind modificări şi din punct de vedere morfologic, exprimate prin pierderea formei alungite clasică, cu devierea către rotunjit. De asemenea observarea culorii mediului este un reper important, virarea acesteia spre galben reprezentând devierea pH-ului mediului către acid.

Forma tachizoţilor de N. caninum a fost cea de cornuleţe (Fig. 4.3.2.), asemănătoare cu cea a tachizoiţilor de T. gondii. Tachizoiţii liberi prezentau mobilitate moderată. În culturile celulare păstrate 10 zile s-a observat că odată cu trecerea timpului forma paraziţilor a devenit tot mai bombată, pierzându-şi aspectul caracteristic, cu micşorarea dimensiunilor şi totodată cu dispariţia mobilităţii. Reinfecţiile culturilor celulare Vero cu aceste forme parazitare învechite au demonstrat că aceştia nu şi-au pierdut complet capacitatea infectantă, infecţia realizându-se însă mult întârziat. Dimensiunile tachizoiţilor au fost de 6-7/2-3 µm, valoare asemănătoare cu a tachizoiţilor de T. gondii şi conformă datelor înregistrate în literatura de referinţă internaţională (Linsday şi Dubey, 1989).

Intervalul dintre pasaje a fost în medie de 4-5 zile, timp în care celulele Vero au fost infectate şi distruse în totalitate cu eliberarea tuturor formelor parazitare şi culoarea mediului de creştere a suferit transformări vizibile macroscopic, virând spre galben, consecinţă a acidifierii acestuia datorită produşilor de metabolism celular eliminaţi în mediu.

Cultivarea şi izolarea „in vitro” pe culturi celulare a lui N. caninum permite efectuarea unui diagnostic în cazul avorturilor la bovine, obţinerea de substrat antigenic care să fie utilizat în diagnosticul serologic al neosporozei, precum şi studierea mecanismelor patogenetice din neosporoză. Cu toate acestea pentru izolarea parazitului din ţesuturi de la animalele infectate (în special sistem nervos central) se recomandă în prima etapă utilizarea animalelor de laborator (şoareci KO – interferon-gamma gene knock out mice), şi intr-o etapă ulterioară culturile celulare. Nu întotdeauna suşele de N. caninum izolate de la animale pot fi adaptate pentru cultivare „in vitro” pe culturi celulare (Vianna şi col., 2005).

N. caninum a fost cultivat cu rezultate bune pe diverse tipuri celulare, cum ar fi linia celulară CV-1, M617 (monocite bovine) (Dubey şi col., 1998), celule primare fetale bovine obţinute din creier (care conţin în principal neuroni, 10-15% astrocite şi 20% celulel neidentificate) (Yamane şi col., 2000), astrocite (Pinheiro şi col., 2006)

Fig. 4.3.1.: Tachizoiţi de N. caninum în culturi celulare (coloraţie Giemsa modificată)

Fig. 4.3.2.: Tachizoiţi de Neospora caninum în culturi celular

4.3.3. Concluzii

Cercetările privind obţinerea pe culturi celulare şi conservarea materialului antigenic de N. caninum, au condus la următoarele concluzii:

Ø celulele Vero au o rezistenţă mare la condiţii de transport dificile (99% au fost viabile după 3 zile de transport);

Ø piruvatul de sodiu nu este indispensabil în supravieţuirea şi multiplicarea celulelor Vero în mediul de cultură RPMI;

Ø primele semne de îmbătrânire celulară sunt reprezentate de apariţia efectului de granulare celulară şi suprapunerea acestora;

Ø la 24h după infecţia culturii celulare Vero cu N. caninum s-a vizualizat prezenţa tachizoiţilor infectanţi în diferite faze de multiplicare;

Ø în spaţiile libere, extracelulare, s-au observat tachizoiţi individuali, iar intracelular dispuşi în pereche;

Ø după 2 zile de cultivare, numai 30% dintre celulele Vero au fost intacte, dar cu prezenţa formelor tachizoidale în citoplasmă;

Ø îmbătrânirea tachizoiţilor de N. caninum se caracterizează prin diminuarea evidentă a mobilităţii, devenind aproape inerţi, cu modificări morfologice, exprimate prin pierderea formei alungite clasică, devenind ovoizi;

Ø tachizoiţii de N. caninum cu vârstă de 10 zile (îmbătrâniţi) nu îşi pierd capacitatea infectantă, dar infecţia substratului celular se realizează într-un timp mai lung;

Ø intervalul dintre pasaje a fost în medie de 4-5 zile, timp în care celulele Vero au fost infectate şi distruse în totalitate.

Indicatori de rezultat generali si specifici

Indicatori generali:

________________________________________________________________________________

| Indicatori de | Denumirea indicatorilor | UM |

| rezultat | | |

| |_________________________________________________|_______|

| | 1. Număr de produse şi tehnologii rezultate din | Nr. |

| | activitatea de cercetare, bazate pe brevete, | |

| | omologări sau inovaţii proprii. | |

| |_________________________________________________|_______|

| | 2. Număr de cereri de brevete depuse în urma | Nr. |

| | proiectelor | |

| | din care: | |

| | a) Naţionale | |

| | b) EPO (Europa) | |

| | c) USPTO (SUA) | |

| | d) Triadice (Europa. SUA. Japonia) | |

| |_________________________________________________|_______|

| | 3. Număr de cereri de brevete acordate (în urma | Nr. |

| | proiectelor) | |

| | din care: | |

| | a) Naţionale | |

| | b) EPO | |

| | c) USPTO | |

| | d) Triadice | |

| |_________________________________________________|_______|

| | 4. Număr de articole publicate în urma | Nr. |

| | proiectelor, | |

| | din care: | 1 |

| | a) în reviste indexate ISI | |

| | b) în reviste indexate în alte baze de date | 1 |

| | internaţionale recunoscute | |

| |_________________________________________________|_______|

| | 5. Număr de articole acceptate spre publicare în| Nr. |

| | urma proiectelor, | |

| | din care: | 1 |

| | a) în reviste indexate ISI | |

| | b) în reviste indexate în alte baze de date | 1 |

| | internaţionale recunoscute | |

| |_________________________________________________|_______|

| | 6. Număr de produse transferabile | |

| |_________________________________________________|_______|

| | 7. Număr de studii de necesitate publică | Nr. |

| | din care: | 2 |

| | a) de interes naţional | 2 |

| | b) de interes regional | |

| | c) de interes local | |

| |_________________________________________________|_______|

| | 8. Număr de IMM participante | % |

| |_________________________________________________|_______|

| | 9. Ponderea contribuţiei financiare private pe | % |

| | proiecte din care contribuţie financiară directă| |

| |_________________________________________________|_______|

| | 10. Numărul mediu de poziţii echivalente cu | Nr. |

| | normă întreagă pe proiect, din care: | |

| | a) doctoranzi | 0.25 |

| | b) postdoctorat | 0.25 |

| |_________________________________________________|_______|

| | 11. Mobilităţi | Lună |

| | din care internaţionale | x-om |

| |_________________________________________________|_______|

| | 12. Valoarea investiţiilor în echipamente |Mii RON|

| | pentru proiecte | 9996 |

| |_________________________________________________|_______|

| | 13. Rata de succes în depunerile de proiecte |66,66% |

| |_________________________________________________|_______|

| | 14. Număr reţele de cercetare susţinute | Nr. |

|____________________|_________________________________________________|___1___|

Indicatorii specifici fiecarei directii de cercetare:

Domeniul de cercetare	Denumirea indicatorului	Numarul	Informatii despre indicator
DC 1 Tehnologiile societăţii informaţionale	Ø Nr. de tehnologii IT performante Ø Nr. tehnologii suport pentru comunicatii; Ø Nr. metode/sisteme de inteligenta artificiala; Ø Nr. produse nanoelectronice si fotonice; Ø Nr.nano- si microsisteme
DC 2: Energie	Ø Nr.concepte de utilizare de noi surse energetice Ø Nr. de tehnologii de reducere a pretului in domeniul energetic Ø Nr. de tehnologii/produse in domeniul securitatii energetice
DC 3: Mediu	Ø Nr. de sisteme şi tehnologii energetice durabile Ø Nr. de tehnologii curate de produs si proces pentru reducerea poluării mediului (green chemistry) Din care: in transporturi Ø Nr.de tehnologii eco-eficiente de valorificare a deseurilor; Ø Nr.concepte si tehnologii de consolidare a diversitatii biologice si ecologice; Nr. de metode si solutii tehnice in domeniul amenajarii teritoriului
DC 4:Sănătate	Ø Nr.concepte/studii ale mecanismelor de adaptare ale organismului; Ø Nr. metode pe baze moderne de investigatie in medicina; Ø Nr. terapii moderne; Nr. de metode de preventie si interventionale la nivel naţional. arondate la spaţiul european de operare
DC 5: Agricultura. securitatea şi siguranţa alimentară	Ø Nr. de produse corespunzătoare principiilor dezvoltării durabile şi securităţii alimentare. inclusiv alimente funcţionale; Ø Nr. de metodologii de detectare a reziduurilor şi contaminanţilor din întreg lanţul alimentar
DC 6: Biotehnologii	Ø Nr.de medicamente noi; Ø Nr.protocoale de diagnostic şi tratamente medicale; Ø Nr.de tehnologii pentru producţia de alimente cu siguranţă maximă asupra sănătăţii umane; Ø Nr.de tehnologii avansate in domeniul · produselor farmaceutice; · grupurilor biocatalitice; · noi enzime şi microorganisme Ø Nr. de sisteme bioinformatice
DC 7: Materiale. procese şi produse inovative	Ø Nr. de materiale avansate Ø Nr.de tehnologii de reciclare a materialelor avansate Ø Nr. de tehnologii avansate de conducere a proceselor industriale Ø Nr. de tehnologii şi produse mecanice de înaltă precizie şi sisteme mecatronice Ø Nr. de tehnologii nucleare Ø Nr. de produse şi tehnologii inovative destinate transporturilor şi producţiei de automobile
DC 8:Spaţiu şi securitate	Ø Nr. de aplicaţii spaţiale integrate Ø Nr. de tehnici aeronautice Ø Nr. de tehnologii aerospaţiale Ø Nr. de tehnici pentru securitate
DC 9:Cercetări socio-economice şi umaniste	Ø Nr. de noi metode manageriale. de marketing şi dezvoltare antreprenorială; Ø Nr. de studii referitoare la calitatea educatiei si a ocuparii; Ø Nr. de studii referitoare la capitalul uman. cultural şi social; Ø Nr.de tehnici de conservare a patrimoniului

l. Evenimente derulate

08.11.2008 – Workshop

Organizare work-shop: Metodologii actuale în diagnosticul protozoozelor abortigene majore la rumegătoare-toxoplasmoza şi neosporoza - CO

În data de 8.11.2008, conform Planului de realizare la contractul de finantare nr. 52-177/2008 a fost organizat workshopul cu tema „Metodologii actuale în diagnosticul protozoozelor abortigene majore la rumegătoare-toxoplasmoza şi neosporoza”. Acesta a fost organizat de către coordonatorul proiectului Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj Napoca, în colaborare cu cei doi parteneri (“Institutul Pasteur” SA Bucureşti şi Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Bucureşti). Acest workshop a fost satelit la cel de-al VIII-lea Congres Naţional de Parazitologie, organizat în perioada 6-8.11.2008 la Cluj Napoca.

În cadrul workshopului au fost prezentate următoarele lucrări:

1. Actualităţi privind neosporoza la bovine şi câine - Vasile Cozma, O. Şuteu, Raluca Gavrea

2. Studiu seroepidemiologic în neosporoză la carnivore (Canis lupus familiaris) şi bovine din judeţul Cluj în anul 2005 - Şuteu Ovidiu, Adriana Titilincu, Vasile Cozma

Seroepidemiologia neosporozei la vaci de lapte de la o fermă din judeţul Mureş - Gavrea Raluca, Gherman Călin, Adriana Titilincu, Viorica Mircean, Cozma Vasile.

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca Facultatea de Medicină Veterinară
	Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Bucureşti Facultatea de Medicină Veterinară	Societatea Naţională “ Institutul Pasteur” S.A Bucureşti Departamentul de Cercetare

INVITAŢIE

Dragi invitaţi,

În ziua de joi, 8 noiembrie 2008, orele 17.45 – 18.30 , Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca, în colaborare cu Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Bucureşti şi Societatea Naţională “Institutul Pasteur” S.A Bucureşti, organizează workshop-ul:

“Metodologii actuale în diagnosticul protozoozelor abortigene majore la rumegătoare – toxoplasmoza şi neosporoza”

în cadrul proiectului PN2 52-177/2008 cu titlul “Investigaţii epidemiologice, diagnostice, patogenetice şi imunologice în neosporoză la bovine şi câine în nord-vestul, centrul şi sudul României”.

Vă adresăm invitaţia de a participa la aceast workshop, fapt care ne onorează şi ridică prestigiul manifestării.

Vă rugăm să confirmaţi participarea Dumneavoastră până la data de 5 octombrie 2008, ora 14.

Vă mulţumim.

Director proiect,

contact: Prof. Dr. Vasile COZMA Prof. Dr. Vasile COZMA

e-mail:vasilecozma@yahoo.com

mobil: 0722/286.320

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca Facultatea de Medicină Veterinară
	Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Bucureşti Facultatea de Medicină Veterinară	Societatea Naţională “ Institutul Pasteur” S.A Bucureşti Departamentul de Cercetare

Programul manifestării

Workshop-ul “Metodologii actuale în diagnosticul protozoozelor abortigene majore la rumegătoare – toxoplasmoza şi neosporoza”

nVineri, 8 octombrie, Amfiteatrul Albastru, Facultatea de Medicină Veterinară Cluj-Napoca

Prezidiu: Vasile Cozma, Dumitru Militaru, Liviu Ioan Mitrea

17:30 - 17:45 Cuvânt de deschidere

Prof. Dr. Vasile Cozma – Director de proiect

17:45 - 18:00 Actualităţi privind neosporoza la bovine şi câine - prezentare

Vasile Cozma, O. Şuteu, Raluca Gavrea

18:00 - 18:05 Studiu seroepidemiologic în neosporoză la carnivore (Canis lupus familiaris) şi bovine din judeţul Cluj în anul 2005 - poster

Şuteu Ovidiu, Adriana Titilincu, Vasile Cozma – Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca

18:05 - 18:10 Seroepidemiologia neosporozei la vaci de lapte de la o fermă din judeţul Mureş - poster

Gavrea Raluca, Gherman Călin, Adriana Titilincu, Viorica Mircean, Cozma Vasile

18:20 - 18:30 Întrebări şi discuţii

18:30 Încheierea lucrărilor Workshop-ului

18:30 - 20:00 Continuarea prezetărilor din cadrul celei de-a 27-a Conferinţe de Parazitologie Cluj-Napoca

20:00 - 24:00 Masă festivă - Restaurant Hotel Napoca

contact: Prof. Dr. Vasile COZMA

e-mail: vasilecozma@yahoo.com

tel: 0722/286.

m. Link-uri:

http://www.cnmp.ro/

http://www.cncsis.ro/

http://www.ancs.ro/

n. Datele de contact ale directorului de proiect

Reprezentant legal
Titlu		Prof. Dr. Ing.				Functia		Rector
Nume		PAMFIL						Prenume	Doru
Nr. Telefon	0264-596384			Nr. Fax	0264- 593792		E-mail	rector@usamvcluj.ro		http:	www.usamvcluj.ro
Persoana responsabila de realizarea proiectului in cadrul organizatiei
Titlu			Prof. Univ. Dr.
Nume			Cozma					Prenume	Vasile
Nr.telefon	0264-596384			Nr. Fax	0264- 593792		E-mail	cozmavasile@yahoo.com		http:	www.usamvcluj.ro